斑馬魚bmp10,dusp1在低溫誘導(dǎo)的凋亡過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、溫度作為影響生物分布的重要因素之一，直接決定了生物體的生理特征和行為。魚類作為最廣泛分布的脊椎動物，其如何來適應(yīng)溫度變化一直以來是環(huán)境生物學(xué)的一個研究熱點。對斑馬魚和羅非魚進(jìn)行低溫脅迫過程中的研究發(fā)現(xiàn)，鰓是最敏感的組織，最容易受到損傷，8℃低溫處理6h和12h有大量高表達(dá)的差異基因參與到凋亡信號通路中。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在鰓細(xì)胞凋亡過程中，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein10,bmp10)和雙特異

2、性磷酸酶（dual-specificity phosphatase1,dusp1）在兩種魚的表達(dá)模式不同，并在凋亡信號通路中起重要調(diào)控作用?；谶@些研究，闡明bmp10,dusp1在斑馬魚分子生物學(xué)過程具有重要意義，將有利于我們進(jìn)一步了解魚類低溫應(yīng)激過程中的適應(yīng)機(jī)制。
　　Bmp10是與心臟發(fā)育息息相關(guān)的BMP家族成員，在心臟、神經(jīng)和軟骨發(fā)育過程中具有重要作用。在哺乳動物中，初步研究發(fā)現(xiàn)，bmp10首先在小鼠胚胎心臟中表達(dá)，突變純

3、合體小鼠，會導(dǎo)致心肌發(fā)育不全，胚胎致死，預(yù)示著bmp10在心臟發(fā)育過程中具有重要調(diào)控功能。但是在斑馬魚胚胎和成體發(fā)育過程中的研究仍不清楚。Dusp1屬于雙特異性磷酸酶，是MAPK家族蛋白的負(fù)調(diào)控基因，參與大量的生理學(xué)活性，包括細(xì)胞信號傳遞、軟骨細(xì)胞生長、細(xì)胞新陳代謝過程等，抑制其表達(dá)或者誘導(dǎo)高表達(dá)都有可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　斑馬魚作為模式生物，具有個體小，容易飼養(yǎng)，并且基因組全序列已經(jīng)被公布等生物學(xué)優(yōu)點，生長速度快，使得斑馬魚

4、成為我們研究魚類生物學(xué)過程和低溫誘導(dǎo)的基因調(diào)控機(jī)制方面的最佳實驗材料。
　　為了揭示bmp10, dusp1與斑馬魚鰓細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，本研究首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚胚胎發(fā)育一細(xì)胞期對bmp10,dusp1進(jìn)行敲除，經(jīng)TUNEL凋亡檢測鰓細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)一步用HE檢測病理變化；其次在斑馬魚胚胎纖維樣ZF4細(xì)胞中進(jìn)行體外驗證，對dusp1進(jìn)行敲降，檢測細(xì)胞凋亡數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bmp10敲除型斑馬魚心肌發(fā)育異常，鰓

5、細(xì)胞發(fā)生水腫，低溫應(yīng)激下，加速心肌細(xì)胞壞死，鰓細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重水腫，導(dǎo)致鰓細(xì)胞凋亡。分析發(fā)現(xiàn)bmp10敲除位點在保守區(qū)域，說明在斑馬魚進(jìn)化過程中具有重要調(diào)控作用，對bmp10進(jìn)行敲除會影響心臟發(fā)育，進(jìn)而在低溫應(yīng)激下會加速鰓細(xì)胞發(fā)生凋亡，水腫現(xiàn)象。Dusp1純合突變體斑馬魚，低溫下，鰓細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加，但是鰓小片未檢測到明顯病理變化。Dusp1敲降型 ZF4細(xì)胞低溫下會促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。分析發(fā)現(xiàn)dusp1序列未檢測到保守區(qū)域，敲除dusp1