柑橘大實(shí)蠅蛹期發(fā)育的基因表達(dá)譜分析及海藻糖代謝相關(guān)基因的研究.pdf

1、柑橘大實(shí)蠅Bactrocera(Tetradacus) minax(Enderlein)是柑橘類(lèi)水果的重要害蟲(chóng)之一，屬雙翅目、實(shí)蠅科、果實(shí)蠅屬。滯育是昆蟲(chóng)特定發(fā)育時(shí)期發(fā)育停滯，新陳代謝降低以抵御周期性的高溫、低溫、干旱和食物缺乏等不良環(huán)境的一種生理現(xiàn)象，以此來(lái)保證昆蟲(chóng)種群和個(gè)體的生存。海藻糖作為昆蟲(chóng)的血糖，在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和滯育方面起著重要作用。本研究通過(guò)對(duì)柑橘大實(shí)蠅海藻糖合成酶（TPS）、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）和海藻糖酶（Tr

2、e）的分子特性和功能展開(kāi)了深入的研究，旨在為進(jìn)一步弄清柑橘大實(shí)蠅滯育分子機(jī)制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.柑橘大實(shí)蠅呼吸速率的測(cè)定
　　對(duì)柑橘大實(shí)蠅整個(gè)蛹期的呼吸速率進(jìn)行測(cè)定，獲得了柑橘大實(shí)蠅蛹期呼吸速率曲線，直接證明了柑橘大實(shí)蠅蛹滯育的發(fā)生。根據(jù)呼吸速率曲線把柑橘大實(shí)蠅蛹期劃分為五個(gè)時(shí)期，即滯育準(zhǔn)備期（PreD）、滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滯育結(jié)束后發(fā)育期（PD）。此外，對(duì)20E注射蛹的呼吸速

3、率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示20E可以打破柑橘大實(shí)蠅蛹的滯育。
　　2.柑橘大實(shí)蠅不同滯育期基因表達(dá)譜分析
　　利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)滯育準(zhǔn)備期（PreD）、滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滯育結(jié)束后發(fā)育期（PD）等五個(gè)點(diǎn)收集的柑橘大實(shí)蠅蛹進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。在十對(duì)兩兩比對(duì)的表達(dá)譜中，總共有4,808條基因顯著上調(diào)或下調(diào)，這些基因主要與新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和消化系統(tǒng)有關(guān)。利用qPCR技術(shù)對(duì)表達(dá)譜的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)

4、果表明隨機(jī)挑選基因的qPCR檢測(cè)結(jié)果與柑橘大實(shí)蠅數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果呈現(xiàn)高度的相關(guān)性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)=0.9534），說(shuō)明柑橘大實(shí)蠅不同蛹期數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果可信。此外，處于滯育維持期的滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期的樣本在兩兩比較的表達(dá)譜中變化差異不大。
　　3.柑橘大實(shí)蠅海藻糖代謝相關(guān)基因克隆及序列分析
　　克隆獲得了柑橘大實(shí)蠅5條海藻糖代謝相關(guān)酶基因cDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為BmTPS、BmTPPB、

5、BmTPPC-1、BmTPPC-2和 BmTre-1。BmTPS開(kāi)放閱讀框2,445 bp，編碼814個(gè)氨基酸殘基。BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2的cDNA開(kāi)放閱讀框分別為825 bp、822 bp、822 bp，分別編碼274、273、273個(gè)氨基酸。BmTre-1的cDNA序列開(kāi)放閱讀框?yàn)?,665 bp，編碼554個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)BmTPS、BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2和BmTre-1蛋白質(zhì)分子

6、量分別為92.05 kDa、31.27 kDa、30.42 kDa、30.85 kDa和63.78 kDa，等電點(diǎn)分別為6.05、7.10、5.63、5.24和5.15。使用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，BmTPS基因與所有雙翅目昆蟲(chóng)TPS聚為一類(lèi)，BmTre-1聚入 Tre-1類(lèi)別。
　　4.柑橘大實(shí)蠅海藻糖代謝相關(guān)基因表達(dá)模式、酶活力及糖含量分析
　　利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)柑橘大實(shí)蠅海藻糖代謝相關(guān)基因在不同發(fā)育階段的的表達(dá)

7、模式進(jìn)行了解析。BmTPS和BmTre-1的表達(dá)模式呈相反的趨勢(shì)，BmTre-1在整個(gè)蛹期表達(dá)量較低，而B(niǎo)mTPS在整個(gè)蛹期表達(dá)量較高。此外BmTPPB、BmTPPC-1和BmTPPC-2基因三者之間的表達(dá)模式有細(xì)微的差別。
　　對(duì)海藻糖合成酶（TPS）、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）和海藻糖酶（Tre）這三種海藻糖代謝相關(guān)酶在整個(gè)蛹期階段的酶活力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）呈現(xiàn)出

8、相同的趨勢(shì)，第60-120天的階段維持高峰，而Tre酶活力卻在60-120天時(shí)下降到最低。
　　對(duì)柑橘大實(shí)蠅整個(gè)發(fā)育階段海藻糖和葡萄糖含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，在柑橘大實(shí)蠅整個(gè)蛹期，其海藻糖含量都維持較高的水平，且波動(dòng)不大。而葡萄糖含量則是從幼蟲(chóng)開(kāi)始至整個(gè)蛹期均較低。
　　對(duì)柑橘大實(shí)蠅1日蛹注射20E后，海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）在化蛹第30天時(shí)相較于對(duì)照組酶活力顯著上升，而海藻糖酶（Tre）在

9、化蛹第30天和第60天時(shí)酶活力相較于對(duì)照組則顯著下降。此外注射20E后，海藻糖含量和葡萄糖含量在30日蛹時(shí)均顯著下降。
　　5.柑橘大實(shí)蠅RNA干擾技術(shù)的初步探究
　　為了建立柑橘大實(shí)蠅RNA干擾體系，本研究將dsBmTPS注射到柑橘大實(shí)蠅三齡幼蟲(chóng)。結(jié)果表明，注射2.0或2.5μg dsBmTPS導(dǎo)致很高的沉默效率，其中注射2.0μg dsBmTPS作用效果最好，可以持續(xù)干擾72 h。BmTPS基因的成功干擾也導(dǎo)致了 BmT