干擾素-α誘導(dǎo)肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌外體(exosomes)mRNA和miRNA表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重要病原體。干擾素α（interferonα，IFN-α）是宿主抵抗病原入侵的天然免疫防線中一種重要細(xì)胞因子，也是目前臨床上治療慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的一線藥物，在病人中有30-40％的應(yīng)答率。然而，目前IFN-α在體內(nèi)抗HBV的具體機(jī)制尚未完全闡明，同時(shí)國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)HBV可通過(guò)多種機(jī)制抑制干擾素的產(chǎn)生、削弱效應(yīng)通

2、路來(lái)拮抗干擾素效應(yīng);體外或者HBV嵌合小鼠內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)IFN-α直接抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(parenchymal cells)中HBV復(fù)制的能力并不強(qiáng)，提示在體內(nèi)干擾素還可能通過(guò)其它途徑發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。
　　外體(exosomes)是一類由細(xì)胞主動(dòng)分泌的大小介于30-100nm，內(nèi)含蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)的微囊結(jié)構(gòu)，廣泛存在于各種體液中。已報(bào)道外體能介導(dǎo)細(xì)胞間的通信，外體內(nèi)含物包有大量功能性的mRNA和microRNA等，通過(guò)水平

3、轉(zhuǎn)移到鄰近或遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞，參與調(diào)控多種重要的細(xì)胞生理活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)室李建華博士發(fā)現(xiàn)IFN-α能作用于肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（non-paranchymal cells，包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等），通過(guò)其分泌的外體在細(xì)胞間傳遞抗病毒分子，這些外體被HBV感染肝細(xì)胞內(nèi)化后可重塑肝細(xì)胞抗病毒狀態(tài)，表明這可能是IFN-α發(fā)揮抗HBV作用的一個(gè)重要機(jī)制。那么IFN-α具體調(diào)節(jié)肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所分泌外體中哪些mRNAs和miRNAs差異分子，這些分子具有哪些功

4、能，是否與抗病毒效果相關(guān)，以及這些分子是否與臨床IFN-α療效有關(guān)聯(lián)，亟待進(jìn)一步深入研究。
　　應(yīng)用全人類基因組生物芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾素處理組與未處理組的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)所分泌外體所攜帶的miRNA和mRNA全基因組表達(dá)譜差異（3組獨(dú)立重復(fù)），有1548種mRNA和22種miRNAs有至少1.5倍以上顯著差異(Fold change，F(xiàn)C≥1.5，p＜0.0

5、5)，其中共618種mRNA和3種miRNAs有1.5倍顯著上調(diào)。逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(qRT-PCR)經(jīng)隨機(jī)檢測(cè)11種上調(diào)mRNA和3種上調(diào)miRNA的表達(dá)，結(jié)果與芯片檢測(cè)的基本一致，驗(yàn)證了LSEC芯片結(jié)果的可靠性。為了解供體細(xì)胞與其外體之間的表達(dá)差異，我們同時(shí)檢測(cè)了IFN-α處理前后LSEC供體細(xì)胞中上述14種分子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞與所分泌外體中分子的上調(diào)水平不一致，提示外體包含的分子具有特定的選入機(jī)制。我們又?jǐn)U展檢測(cè)了另一種

6、重要的肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞來(lái)源的THP-1細(xì)胞本身及所分泌的外體中上述分子的表達(dá)，其結(jié)果基本與LSEC中的趨勢(shì)一致，進(jìn)一步表明特定RNA分子存在于IFN-α處理的肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所分泌的外體中，可能是一種廣泛性的機(jī)制。
　　通過(guò)生物信息學(xué)方法分析在IFN-α處理后差異上調(diào)的618個(gè)mRNA中，發(fā)現(xiàn)有Ⅰ型干擾素通路分子和49種干擾素調(diào)節(jié)相關(guān)基因(interferon regulated genes，IRGs)的富集，差異上調(diào)的3種

7、miRNA通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)表明能參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，主要與細(xì)胞代謝通路相關(guān)。這些眾多的上調(diào)分子為進(jìn)一步篩選具有天然抗HBV活性分子提供一個(gè)較可靠數(shù)據(jù)庫(kù)。初步驗(yàn)證上述基因中的14種分子是否具有抗HBV活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CALHM1，F(xiàn)ABP5，DDIT3，miR-638，miR4-284轉(zhuǎn)染對(duì)上清HBsAg的表達(dá)量有顯著抑制（ELISA檢測(cè)，p＜0.01）;CALHM1，miR-4284對(duì)HBeAg也有顯著抑制（ELISA檢測(cè)，p＜0.01

8、）。
　　為了驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床干擾素治療慢性乙肝(CHB)病人樣本中的相關(guān)性，在34例長(zhǎng)效干擾素(PEG-IFN-α)治療有早期快速病毒學(xué)應(yīng)答(Early virological response，EVR)和40例PEG-IFN-α治療無(wú)EVR(對(duì)照組)的CHB病人血清樣本中，用Exo-quickTM法提取血漿外體，qRT-PCR比較上述14種mRNA和miRNA差異分子的水平變化。發(fā)現(xiàn)在有EVR應(yīng)答CHB病人中，第3個(gè)月較

9、0個(gè)月血漿外體中的miR-638、miR-4284、miRNA-1260以及IFITM mRNA分子的相對(duì)升高倍數(shù)，較無(wú)EVR病人有顯著升高(p＜0.01)。且IFITM的升高倍數(shù)與有EVR應(yīng)答病人的HBV DNA拷貝數(shù)的下降成相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)為0.4045，p＜0.001），提示了外體中這些mRNA和miRNA分子作為指示IFN-α應(yīng)答效果生物標(biāo)志物(biomarker)的可能性。
　　綜上所述，本研究分析了IFN-α誘導(dǎo)肝非實(shí)