NAD（P）H氧化酶在TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá)炎癥因子及轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、本研究旨在探討NADH氧化酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在TGF-β1刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá)炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)積聚及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步探討腎臟纖維化的防治措施提供新的途徑和方法。 第一章NADH氧化酶在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞ROS產(chǎn)生中的作用 目的：探討NADH氧化酶在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞ROS產(chǎn)生中的作用。 材料和方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組 正常培

2、養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞株無(wú)血清培養(yǎng)24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然后用TGF-β和NRK-52E細(xì)胞共同孵育，觀察TGF-β1刺激不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)NADH氧化酶各亞單位表達(dá)的影響；同時(shí)觀察TGF-β1刺激后細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響，部分實(shí)驗(yàn)采用NADH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理1h或轉(zhuǎn)染shRNA，分別收集總RNA和蛋白以備檢測(cè)。 2.方法 分別用RT-PCR檢測(cè)NADH氧化酶p47phox、p67phox、p22phox、gp91phox

3、mRNA的表達(dá)；用熒光探針及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；Westernblot檢測(cè)NADH氧化酶亞單位p67phox的蛋白表達(dá)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量 資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1.TGF-β1對(duì)NRK-52E細(xì)胞NADH氧化酶表達(dá)的影響及shRNA-p67phox的作用 NRK-52E細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激以后，

4、NADH氧化酶亞單位p67phoxmRNA的表達(dá)逐漸增加，而TGF-β1刺激后，NADH氧化酶亞單位的表達(dá)無(wú)明顯改變。RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，p67phoxmRNA的表達(dá)在基礎(chǔ)水平和TGF-β1刺激后均有下調(diào)。同樣，Westernblot結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，p67phox蛋白的表達(dá)在基礎(chǔ)水平和TGF-β1刺激后均有下調(diào)。 2.DPI及shRNA-p67p

5、hox對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 TGF-β1刺激5min可明顯增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，為正常水平的2.5倍。DPI預(yù)處理后，可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，較TGF-β1刺激刺激組降低了43.69％。同樣，與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生在基礎(chǔ)水平和TGF-β1刺激后均有下調(diào)。 小結(jié)： 1.TGF-β1可刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞NAD

6、H氧化酶亞單位p67phox的表達(dá)上調(diào)及ROS產(chǎn)生增加； 2.抑制NADH氧化酶活性可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。 3.沉默NADH氧化酶p67phox亞單位可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。 第二章NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞炎癥因子上調(diào)表達(dá)中的作用 目的：探討NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞

7、合成和分泌炎癥因子中的作用。 材料和方法： 同第一章。 結(jié)果： 1.TGF-β1對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響及DPI和shRNA-p67phox的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，正常細(xì)胞僅有少量MCP-1的表達(dá)，TGF-β1可明顯上調(diào)MCP-1的mRNA表達(dá)，使用DPI不同濃度預(yù)處理1h后，TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1mRNA表達(dá)明顯受到抑制。ELISA結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相似，TG

8、F-β1可明顯增加上清液中MCP-1的濃度，12h開始明顯增加，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白量逐漸增加，72h達(dá)最高。不同濃度DPI預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1蛋白的生成明顯受到抑制。0.5％DMSO對(duì)MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá)均無(wú)抑制作用。RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，MCP-1mRNA的表達(dá)在基礎(chǔ)水平分別下降了45.36％和52.01％。 2.TGF-β1對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞I

9、L-6表達(dá)的影響以及DPI和shRNA-p67phox的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，IL-6mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)DPI預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的IL-6mRNA的表達(dá)明顯受到抑制，DMSO對(duì)IL-6mRNA的表達(dá)無(wú)抑制作用。 小結(jié)： 1.TGF-β1可促使大鼠腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá)炎癥因子MCP-1和IL-6。 2.抑制NADH氧化酶活性可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮

10、細(xì)胞MCP-1和IL-6的上調(diào)表達(dá)。 3.沉默NADH氧化酶p67phox亞單位可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞MCP-1和IL-6的上調(diào)表達(dá)。 第三章NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)積聚中的作用 目的：NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)積聚中的作用。 材料和方法： 同第二章。 結(jié)果： 1.TGF-

11、β1對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞COL-I表達(dá)的影響及DPI的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β可明顯增加COL-ImRNA的表達(dá)，Westernblot結(jié)果也顯示，TGF-β1可明顯增加COL-I蛋白的合成，與RNA表達(dá)趨勢(shì)相一致。RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1可明顯增加COL-ImRNA的表達(dá)，與TGF-β1組比較，DPI組COL-ImRNA的表達(dá)明顯受到抑制，Westernblot結(jié)果也顯示，DPI可明顯抑制COL-I

12、蛋白的表達(dá)，較單純TGF-β1刺激組下降了40.85％。 2.TGF-β1對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)的影響及DPI的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，PAI-1mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Westernblot結(jié)果也顯示，TGF-β1可明顯增加PAI-1蛋白的合成，RT-PCR結(jié)果也顯示，TGF-β1可明顯增加PAI-1mRNA的表達(dá)，DPI組PAI-1mRNA的表達(dá)明顯受到抑制，Westernblo

13、t結(jié)果也顯示，DPI組PAI-1蛋白的表達(dá)明顯受到抑制。 小結(jié)： 1.TGF-β1可明顯上調(diào)大鼠腎小管上皮細(xì)胞PAI-1和COL-I的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。 2.抑制NADH氧化酶活性可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞PAI-1和COL-I的表達(dá)。 第四章NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用 目的：NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的大

14、鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用。 材料和方法： 同第二章。 結(jié)果： 1.TGF-β1對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響及DPI的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，α-SMAmRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，免疫熒光結(jié)果也顯示，正常對(duì)照組α-SMA幾乎看不到，TGF-β1刺激組，α-SMA的陽(yáng)性信號(hào)明顯增加。Westernblot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，TGF-β1可明顯增加α-SMA蛋白的表達(dá)

15、，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)逐漸增加，DPI預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA蛋白的生成明顯受到抑制，DMSO對(duì)α-SMA的表達(dá)無(wú)顯著作用。 2.TGF-β1對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)的影響及DPI的作用 RT-PCR結(jié)果顯示，NRK-52E細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后，E-CadherinmRNA的表達(dá)逐漸降低，免疫熒光結(jié)果也顯示，正常對(duì)照組E-Cadherin在細(xì)胞膜表達(dá)完整，TGF-β1刺激組，E-

16、Cadherin的表達(dá)明顯降低。Westernblot結(jié)果顯示，TGF-β1可顯著降低E-Cadherin蛋白的表達(dá)，與基因水平相一致。RT-PCR結(jié)果顯示，DPI組TGF-β1誘導(dǎo)的E-Cadherin的下調(diào)得到改善，0.5％DMSO對(duì)E-Cadherin的表達(dá)無(wú)顯著作用。 小結(jié)： 1.TGF-β1可明顯上調(diào)α-SMAmRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E-CadherinmRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化；

17、 2.抑制NADH氧化酶活性可部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的上調(diào)表達(dá)及E-Cadhedn的下調(diào)表達(dá)。 總結(jié)： 1.TGF-β1可刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞NADH氧化酶亞單位p67phox表達(dá)上調(diào)及增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生； 2.TGF-β1可刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞合成與分泌炎癥因子增加，抑制NADH氧化酶的活性和表達(dá)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1和IL-6的上調(diào)表達(dá)； 3.TG