脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)35型致病基因TGM6的細(xì)胞功能研究.pdf

1、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(Spinocerebellar ataxia，SCA)是一大類呈常染色體顯性遺傳的，具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病多在30歲至40歲左右發(fā)病，主要病理改變是小腦和腦干的萎縮，以進(jìn)行性小腦性共濟(jì)失調(diào)、走路不穩(wěn)、構(gòu)音障礙為主要臨床表現(xiàn)，有時伴有眼肌麻痹、認(rèn)知功能障礙、周圍神經(jīng)病、錐體束征和視網(wǎng)膜色素變性等表現(xiàn)。到目前為止，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多種SCA亞型。在前期工作中，我們對中國漢族人群SCA各亞型的分

2、布頻率及各亞型CAG重復(fù)次數(shù)的特點(diǎn)，制定了一套SCA基因診斷流程，建立了SCA致病基因的診斷平臺。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中，SCA3最為常見，其次為SCA2、SCA1和SCA7等亞型。
　　近幾年，以全基因組外顯子測序技術(shù)(Whole exome sequencing，WES)為代表的新一代測序技術(shù)具有高通量、高精度、高靈敏度、低運(yùn)行成本等突出技術(shù)優(yōu)勢，為人類遺傳疾病的研究開辟了又一個新途徑。2010年，我們課題組在國際上率先聯(lián)

3、合應(yīng)用連鎖分析結(jié)果和外顯子測序技術(shù)克隆了一個新的SCA亞型SCA35的致病基因TGM6，TGM6基因的兩種錯義突變D327G和L517W都可以致病。2012年，香港學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGM6的另外一種形式的錯義突變D150H也可以導(dǎo)致SCA的發(fā)生，更進(jìn)一步證實(shí)了我們前期工作的可靠性。
　　TGM6編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶6蛋白(Transglutaminase6，TG6)屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族(Transglutaminases, TGs)。TGs

4、是一類鈣離子依賴性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，在哺乳動物中有活性的TG共8種，主要催化谷氨酰胺上的甲酰胺基團(tuán)與多種親核基團(tuán)反應(yīng)。TG6在2001年才首次被人類發(fā)現(xiàn)，目前尚無關(guān)于TG6蛋白的功能研究。
　　為進(jìn)一步研究TGM6基因突變在SCA35亞型中的發(fā)病機(jī)制，我們通過過表達(dá)野生型及突變型TG6蛋白的細(xì)胞模型，進(jìn)行相關(guān)的一系列體外功能實(shí)驗，包括Western blot檢測蛋白表達(dá)及TG6蛋白的降解，TG蛋白酶活性檢測，細(xì)胞免疫熒光觀察其亞細(xì)胞

5、定位，GST pulldown及免疫共沉淀尋找其相互作用的蛋白以及探討TG6蛋白在細(xì)胞凋亡中的作用等研究。
　　結(jié)論:
　　(1)成功構(gòu)建了野生型及兩種突變型TGM6重組真核、原核表達(dá)載體，為研究野生型TG6蛋白的生理功能及突變型TG6蛋白導(dǎo)致SCA35的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)通過脂質(zhì)體將野生型及突變型TGM6重組真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，Western blot技術(shù)檢測TG6蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)野

6、生型及突變型TG6蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異。
　　(3)蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗證實(shí)，突變型TG6蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，在體內(nèi)很容易被降解，半衰期明顯縮短。
　　(4)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，野生型及突變型TG6蛋白主要位于細(xì)胞漿中，與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體沒有明顯的共定位。
　　(5) TG活性檢測發(fā)現(xiàn)，突變型TG6蛋白的TG活性較野生型明顯下降，尤其以L517W突變體的活性降低最為顯著。
　　(6)在HEK293細(xì)胞中，

7、野生型及突變型TG6蛋白與polyQ蛋白(ataxin-3-20Q、ataxin-3-70Q、Htt-150Q)存在著部分共定位;GSTpull down及免疫共沉淀結(jié)果表明，野生型及突變型TG6蛋白與polyQ蛋白之間存在著相互作用;且均能通過促進(jìn)polyQ蛋白由可溶性轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苓M(jìn)而促使其形成細(xì)胞內(nèi)聚集體。
　　(7)過表達(dá)TG6蛋白對HEK293和NIH3T3細(xì)胞的凋亡率沒有顯著影響。但在A23187和STS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中