紅景天苷的超高壓提取及其藥理活性的初步研究.pdf

1、紅景天(Rhodiola rosea)系景天科紅景天屬多年生草本植物，具有安眠鎮(zhèn)靜、耐缺氧、延緩衰老、抗輻射等藥理活性，是著名的一味滋補藥材，其強壯機體之功效可媲美人參、刺五加，在我國中醫(yī)臨床上有著悠久的應(yīng)用歷史。此藥材含有紅景天苷、酪醇等活性成分，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤的藥理活性，近幾年國內(nèi)外有大量有關(guān)于其藥理作用的報道。
　　 但因當(dāng)前提取技術(shù)發(fā)展的限制，傳統(tǒng)的提取技術(shù)在提取效率、提取后活性方面存在一定的不足。超高壓提取技

2、術(shù)的出現(xiàn)，很好的彌補了這些缺陷，相比傳統(tǒng)提取方法，超高壓提取具有其獨特的優(yōu)勢，如溶劑消耗少、室溫下即可提取、提取率高、節(jié)能等等。近幾年，國內(nèi)外有大量相關(guān)文獻報道使用超高壓提取法用于中藥材有效成分的提取，且實驗結(jié)果普遍優(yōu)于常規(guī)方法，但尚未見超高壓提取技術(shù)應(yīng)用于紅景天藥材的提取的報道，對超高壓提取紅景天中紅景天苷的最優(yōu)工藝尚不明確;紅景天抗氧化活性研究大多集中于常規(guī)提取方法的提取物及活性單體化合物上，尚未有紅景天超高壓提取物抗氧化活性的報道

3、，且未見關(guān)于紅景天超高壓提取法與其他常規(guī)提取法所得提取物之間抗氧化活性相對強弱的比較;此外，很多研究人員已對紅景天常規(guī)提取法所得提取物及其主要活性成分紅景天苷體外抑制腫瘤細胞生長活性做過研究，但未見關(guān)于紅景天超高壓提取法與常規(guī)提取法所得提取物對腫瘤細胞體外增殖抑制活性差異比較的相關(guān)報道。
　　 因此，本文擬采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法(CCD-RSM)優(yōu)選出超高壓提取紅景天中紅景天苷的最佳工藝條件，并在同等提取條件下，與其他常見提取技

4、術(shù)就提取得率進行比較，評價各提取方法的優(yōu)劣;同時對超高壓提取和其他常規(guī)提取技術(shù)的粗提取物就體外抗氧化活性進行比較研究，運用不同的測定方法，建立一系列體外抗氧化體系，來測定這四種提取物及紅景天苷對DPPH·、O2-、OH·等自由基的清除能力，及對脂質(zhì)過氧化的抑制活性，還原能力和總抗氧化能力，綜合評價四種提取方法所得紅景天粗提取物和紅景天苷單體的抗氧化活性強弱大小;此外，選取體外培養(yǎng)的人非小細胞肺癌A549細胞和人鼻咽癌CNE-2細胞作為研

5、究對象，采用MTT法觀察紅景天超高壓提取物和其他三種常規(guī)提取法所得提取物對A549細胞和CNE-2細胞的體外增殖抑制作用的差異，初步評價四種提取物細胞抑制活性的強弱。
　　 研究目的:
　　 1、采用CCD-RSM原理優(yōu)選出超高壓提取紅景天苷的最佳工藝條件，并就紅景天苷得率與其他提取法進行比較分析，初步評價各提取法之優(yōu)劣。
　　 2、綜合比較紅景天各提取方法所得粗提物的體外抗氧化活性，并就活性差異產(chǎn)生的原因進行初

6、步討論。
　　 3、利用MTT法初步比較四種提取方法所得紅景天粗提取對A549和CNE-2細胞體外增殖抑制活性差異。
　　 研究方法:
　　 1、星點設(shè)計-效應(yīng)面積法優(yōu)化超高壓提取紅景天中紅景天苷
　　 ①、將紅景天藥材預(yù)處理后，置于密實袋中，按相應(yīng)料液比加入預(yù)設(shè)濃度的提取溶劑，放入等靜壓機，按照預(yù)設(shè)參數(shù)進行操作。將粗提液高速離心，直至變得澄清，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜抽濾。②、通過預(yù)實驗選定液相色

7、譜儀的色譜條件，配制一定濃度梯度的標(biāo)準品溶液，繪制標(biāo)準曲線，在同樣條件下測定待測樣品溶液并計算平均峰面積，最后根據(jù)標(biāo)準曲線計算紅景天苷提取率。③、借助Design-Expert8.0.0軟件依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面立體分析圖及等高線，考察所擬合的響應(yīng)面曲線的形狀，根據(jù)響應(yīng)面圖對任何兩個考察因素之間的交互關(guān)系進行分析和評價，確定最佳工藝。④、在同等條件下，對超高壓提取法和其他三種常規(guī)方法進行提取率的比較，綜合評定各提取法的優(yōu)劣。
　　

8、 2、各提取法所得提取物及紅景天苷體外抗氧化活性的測定
　　 ①、按預(yù)設(shè)的實驗參數(shù)，分別采用超高壓提取、回流提取、超聲輔助提取及微波提取等四種提取方法對紅景天進行提取操作，得各提取方法的粗提液，分別用英文簡寫UPER、RER、UER、MER表示，作為待測樣品溶液;另配制呈梯度濃度的紅景天苷標(biāo)準品溶液，同樣作為待測樣品溶液;②、分別配制DPPH·反應(yīng)液、產(chǎn)生O2-的NADH-NBT-PMS溶液體系、產(chǎn)生OH·的Fe3+-EDTA

9、-抗壞血酸-H2O2溶液體系、以卵黃脂蛋白作底物的脂質(zhì)過氧化模型反應(yīng)體系、K3Fe(CN)6-Fe3+還原能力模型反應(yīng)體系、β-胡蘿卜素-亞油酸自氧化體系，按比例加入待測樣品溶液，于相應(yīng)的反應(yīng)條件下作用后，在特定波長處測定吸光度值，按相應(yīng)公式計算待測樣品對DPPH、O2-、OH·自由基的清除率，對脂質(zhì)的過氧化抑制能力以及還原能力、總抗氧化能力;③、計算待測樣品及陽性對照品在各抗氧化活性測定指標(biāo)下的IC50值，不同濃度的四種粗提液在某一抗

10、氧化體系中的抗氧化活性采用兩因素多水平析因設(shè)計方差分析，先做方差齊性檢驗:方差齊同，采用SNK-q法進行兩兩之間全面比較;方差不齊，采用Dunnett T3法進行組間兩兩比較，顯著性水準α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3、四種紅景天粗提物溶液對A549和CNE-2細胞增殖抑制作用的比較
　　 ①、按預(yù)設(shè)的實驗參數(shù)，分別采用超高壓提取、回流提取、超聲輔助提取及微波提取等四種提取方法對紅景天進行提取操作，得

11、各提取方法的粗提液，分別以英文簡寫UPER、RER、UER、MER表示，作為待測樣品溶液;以5-氟尿嘧啶（5-Fu）作陽性對照藥物;②、MTT法繪制A549和CNE-2細胞的生長曲線，確定兩腫瘤細胞系最佳生長狀態(tài)時間點為培養(yǎng)后48h;③、利用MTT法進一步測定加藥后72h各處理組的細胞增殖抑制率，然后計算四種待測樣品及5-Fu對兩細胞系增殖抑制的IC50值。不同濃度的四種粗提液處理A549和CNE-2細胞后的體外增殖抑制率采用兩因素多水

12、平析因設(shè)計方差分析，先做方差齊性檢驗:方差齊同，采用SNK-q法進行兩兩之間全面比較;方差不齊，采用Dunnett T3法進行組間兩兩比較，顯著性水準α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、星點設(shè)計-效應(yīng)面積法優(yōu)化超高壓提取紅景天中紅景天苷
　　 超高壓提取紅景天中紅景天苷的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度77.3％、液固比為29.5、提取壓力為255.5Mpa，此時紅景天中紅景天苷提

13、取率的最大估計值Y=9.46 mg·g-1;超高壓提取法提取紅景天中紅景天苷的提取率(9.29 mg·g-1)、要高于其他三種提取方法（回流:7.10mg·g-1;超聲:7.72mg·g-1;微波:8.48mg·g-1），且提取所用時間(2 min)明顯短于回流提取法(2 h)和超聲提取法(30min)。
　　 2、各提取方法所得提取物及紅景天苷單體的體外抗氧化活性測定
　　 本實驗共模擬了六種體外自由基發(fā)生體系，包括D

14、PPH·、NBT-NADH-PMS、Fe3+-EDTA-抗壞血酸-H2O2、卵黃脂質(zhì)過氧化模型反應(yīng)體系、還原鐵氰化鉀以及β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系，分別測定了四種提取法所得粗提物溶液UPER、UER、MER、RER對DPPH·、O2-·、OH·三種自由基的清除能力，以及它們對脂質(zhì)過氧化的抑制能力、還原能力、總抗氧化活性，以此來比較研究不同提取技術(shù)提取得到的紅景天粗提物的體外抗氧化活性。
　　 綜合六種體外抗氧化活性評價方法的

15、實驗結(jié)果:①、除O2-·清除活性四種粗提物無顯著差異外，UPER對DPPH·、OH·清除活性以及抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力、總抗氧化活性五個測定指標(biāo)均大于MER、RER; UPER在OH·清除活性、抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力三個指標(biāo)方面優(yōu)于UER，在DPPH·、總抗氧化活性兩個指標(biāo)方面與UER相當(dāng)。②、UER在DPPH·清除活性、總抗氧化活性兩個測定指標(biāo)上均要大于MER，而在OH·、O2-·清除活性以及抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力四

16、個指標(biāo)方面與MER大小相當(dāng);除O2-·清除活性外，在其它五個體外抗氧化活性測定指標(biāo)上UER均要強于RER。③、MER在DPPH·、OH·清除活性以及抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力四個指標(biāo)上表現(xiàn)得優(yōu)于RER，而在O2-·清除活性、總抗氧化活性兩個指標(biāo)方面MER、RER活性大小相當(dāng)。
　　 因此由以上比較可以對四種提取方法所得紅景天粗提物體外抗氧化活性進行總體評價，得出以下初步結(jié)論:UPER＞UER＞MER＞RER。
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17、、四種紅景天粗提物溶液對A549和CNE-2細胞增殖抑制作用的比較
　　 MTT法檢測結(jié)果表明:①、四種粗提物溶液UPER、UER、MER、RER對A549細胞增殖生長的半數(shù)抑制濃度IC50依次為2.088mg/ml、2.237mg/ml、1.974mg/ml、2.931 mg/ml，故體外抗腫瘤活性大小順序依次為:MER＞UPER＞UER＞RER。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果同樣證明，UPER、UER、MER兩兩之間無顯著性差異(P＜0.05)

18、，而UPER、UER、MER三者之一與RER之間均有顯著性差異(P＞0.05)。故UPER、UER、MER對A549細胞增殖抑制活性相當(dāng)，且均要強于RER。②、UPER、UER、MER、RER對CNE-2細胞增殖生長的半數(shù)抑制濃度IC50依次為2.239mg/ml、2.385mg/ml、2.277mg/ml、2.782mg/ml。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明，UPER、MER兩者間的體外增殖抑制活性無顯著性差異(P＜0.05)，UER與MER間無顯著

19、性差異(P＜0.05)，UPER與UER間有顯著性差異(P＞0.05)，而UPER、UER、MER三者之一與RER之間均有顯著性差異(P＞0.05)，故UPER、UER、MER三者對CNE-2細胞株增殖抑制活性相當(dāng)，而RER的抑制活性要低于前三者。
　　 研究結(jié)論:
　　 (1)、從紅景天中提取紅景天苷，就提取得率而言，超高壓提取法要優(yōu)于回流提取、微波提取法和超聲輔助提取法。
　　 (2)、與其他三者常規(guī)提取法相