大劑量過敏原誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞不反應(yīng)性及機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明<'[1-3]>。Th2細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用<'[3-5]>。目前研究發(fā)現(xiàn)，“Th1/Th2偏移”假說不能完全解釋哮喘的免疫學(xué)機(jī)制異常<'[6-10]>，近年又提出了“免疫耐受缺陷”的假說。正常人接觸過敏原后不會發(fā)生Th2細(xì)胞的過

2、度活化，這是因?yàn)檎Ｈ丝梢詫^敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接觸過敏原后T細(xì)胞異?；罨鲋澈头只癁門h2細(xì)胞，引起“Th1/Th2偏移”，始動哮喘的氣道炎癥。“免疫耐受缺陷”的假說從更深的層次解釋了哮喘發(fā)病的免疫學(xué)異常，可能是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。 過敏原特異性免疫治療(SIT)是目前已知唯一針對哮喘病因的治療方法，它在一定程度上可以改善這種免疫耐受的缺陷，但其作用機(jī)制目前尚不完全清楚<'[11-12]>。近年

3、來研究發(fā)現(xiàn)，成功的SIT，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的誘導(dǎo)產(chǎn)生起重要作用<'[11-15]>。哮喘體內(nèi)Tregs功能的異常和分化數(shù)量的減少，在哮喘的變應(yīng)性氣道炎癥中起重要作用<'[16-19]>。調(diào)控Tregs的具體機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β、Notch信號均與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)<'[20-23]>。既往研究顯示大劑量過敏原在體外可誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞不反應(yīng)性<'[24]>。大劑量過敏原是通過

4、何種機(jī)制誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞不反應(yīng)性目前尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度OVA對致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子分泌的作用，以及大劑量OVA體外處理分別對IL-10和TGF-β分泌的作用，對DC表面共刺激信號表達(dá)的作用、對Tregs極化的作用、對T-bet和GATA3表達(dá)以及Notch信號表達(dá)的作用，以研究其誘導(dǎo)T細(xì)胞不反應(yīng)性的具體機(jī)制。 研究內(nèi)容和方法： 1．復(fù)制致敏小鼠模型，并分離培養(yǎng)致敏及正常對照小鼠脾臟DC和T細(xì)

5、胞。 2．不同濃度的OVA體外處理致敏和正常對照小鼠脾臟DC和T細(xì)胞，ELISA檢測Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌情況，不同濃度的過敏原體外處理致敏和正常對照小鼠脾臟DC，ELISA檢測IL-10，TGF-β1的分泌水平，并分析與Th1/Th2因子的相關(guān)性。 3．流式檢測致敏及正常對照小鼠脾臟DC表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表達(dá)。致敏小鼠脾臟DC與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后，流式檢測并比

6、較CDS0、CD86等共刺激分子的表達(dá)。 4．分離小鼠CD4+T細(xì)胞，流式檢測致敏小鼠和正常對照小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量。致敏小鼠脾臟DC、CD4+T細(xì)胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后，流式檢測CD4+CD25+FoXp3+T細(xì)胞的數(shù)量。 5．RT-PCR和Westem blotting法分別檢測致敏小鼠和正常對照小鼠T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表達(dá)水平。致敏小鼠

7、脾臟DC、CD4+T細(xì)胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后，RT-PCR和Western blotting法分別檢測T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表達(dá)。 6．RT-PCR和Western blotting法分別檢測致敏小鼠和正常對照小鼠DC和T細(xì)胞Notch配體和受體的mRNA及蛋白表達(dá)水平。致敏小鼠脾臟DC、T細(xì)胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后，RT-PCR和Western blotting法分別檢

8、測Jagged1和Notch3表達(dá)。 7．分離培養(yǎng)小鼠骨髓DC，流式檢測表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表達(dá)。 8．應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將Notch配體Jagged1轉(zhuǎn)染小鼠骨髓DC。RT-PCR和Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染DC中目的基因表達(dá)狀況。 9．Jaggedl轉(zhuǎn)染DC與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC分別與致敏小鼠CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，流式檢測CD4+CD25+F

9、oxp3+T細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果： 1．在0～1mg/ml濃度范圍內(nèi)，致敏小鼠Th2細(xì)胞因子的分泌隨處理濃度增高而增高，但在10mg/ml的OVA作用下，IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的分泌水平則較其他組明顯降低(p<0.05)。IL-2和IFN-γ的分泌也受到明顯抑制(p<0.05)。而對正常對照小鼠T細(xì)胞，OVA濃度的變化對其Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌無影響。 2．在0～10mg/ml濃度范圍內(nèi)，致敏小鼠分泌IL

10、-10，TGF-β1水平隨處理濃度增高而增高，正常對照小鼠各濃度處理組之間無顯著差異。致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子水平與IL-10和TGF-β1水平無明顯相關(guān)性。 3．致敏小鼠脾臟DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCII表達(dá)顯著高于正常對照小鼠。10mg/ml的OVA作用后，致敏小鼠脾臟DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)明顯降低。 4．致敏小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量顯著低于

11、正常對照小鼠。10mg/ml的OVA作用后，致敏小鼠CD4+CD25+F0xp3+T細(xì)胞數(shù)量顯著上升。 5．致敏小鼠T細(xì)胞T-bet的mRNA及蛋白表達(dá)較正常對照小鼠顯著降低，而GATA-3的表達(dá)較正常照小鼠顯著升高。大劑量過敏原(10mg/ml的OVA)作用下致敏小鼠T細(xì)胞T-bet的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組顯著降低，GATA-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組顯著降低。 6．致敏小鼠脾DC Notch配體Jag

12、ged1、Jagged2以及Deltal mRNA的表達(dá)較正常對照小鼠顯著降低，而Delta3、Delta4 mRNA的表達(dá)則與正常對照小鼠相比無顯著差異。致敏小鼠T細(xì)胞Notch受體Notch1、Notch3 mRNA的表達(dá)較正常對照小鼠顯著降低，而Notch2，Notch4 mRNA的表達(dá)則與正常對照小鼠相比無顯著差異。大劑量過敏原(10mg/ml的OVA)體外處理后致敏小鼠DC Jaggedl和T細(xì)胞Notch3的mRNA表達(dá)均較

13、對照組顯著增加。 7．致敏小鼠脾臟DC Jagged1蛋白表達(dá)及T細(xì)胞Notch3蛋白表達(dá)均顯著低于正常對照小鼠。大劑量OVA體外處理后Jagged1及Notch3蛋白表達(dá)水平顯著上升。 8．RT-PCR半定量法及Western Blotting證實(shí)Jaggedl轉(zhuǎn)染骨髓DC內(nèi)有轉(zhuǎn)染基因mRNA及蛋白表達(dá)。 9．致敏小鼠CD4+T細(xì)胞經(jīng)Jaggedl轉(zhuǎn)染DC處理后，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多。

14、 結(jié)論： 1．大劑量過敏原在體外可誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞的不反應(yīng)性，其機(jī)制與降低致敏小鼠DC共刺激分子表達(dá)，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞極化等有關(guān)。 2．致敏小鼠DC/T細(xì)胞Notch信號配體/受體表達(dá)有明顯的降低。大劑量過敏原在體外作用可上調(diào)其表達(dá)。Jaggedl轉(zhuǎn)染DC能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞極化。以上提示Notch信號途徑的“缺陷”可能是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞極化不足的重要原因。 本文的結(jié)果證明，大劑量過敏原可以恢復(fù)變應(yīng)原致敏T細(xì)