牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白制備、中試生產(chǎn)設(shè)計(jì)及其致敏性的細(xì)胞學(xué)評(píng)估.pdf

1、食物過(guò)敏是食物中某種成分（變應(yīng)原或過(guò)敏原）刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一種異常的病理性免疫應(yīng)答。八大類(lèi)食物過(guò)敏原中牛乳過(guò)敏較為普遍，而β-乳球蛋白是牛乳主要的過(guò)敏原之一，由反芻動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞合成，含量約占乳清蛋白總量的55％，人乳中則不含有。
　　本文采用制備型反相高效液相色譜獲得高純度的牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白，對(duì)其進(jìn)行輻照協(xié)同超聲非熱加工處理。通過(guò)光譜學(xué)方法表征不同加工處理后過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)特征，在此基礎(chǔ)上，利用人外周血嗜堿性粒細(xì)胞 KU

2、812，建立體外細(xì)胞模型評(píng)估蛋白致敏性變化。文章關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)方法、現(xiàn)象結(jié)果及結(jié)論表述如下。
　　1.建立制備型反相高效液相色譜儀（C18）分離純化牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白的方法，小試實(shí)驗(yàn)僅用25 min，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，得到的β-乳球蛋白純度達(dá)到98.2%，得率為32.25%?；谛≡噮?shù)進(jìn)行十倍放大的中試工藝設(shè)計(jì)，選取C18色譜柱（直徑25 mm，長(zhǎng)度250 mm），上樣量100 mL，體積10 mg/mL，并完成設(shè)備的選型

3、，繪制工藝流程圖和設(shè)備流程圖。
　　2.牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白經(jīng)超聲（40KHz，300W，30min）和輻照（5 kGy）協(xié)同處理，分為四組：原蛋白組，輻照組；先超聲后輻照組，先輻照后超聲組。加工后蛋白發(fā)生不同程度的聚合，一級(jí)和空間結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度的改變。在蛋白聚合過(guò)程中，二級(jí)結(jié)構(gòu)從無(wú)序轉(zhuǎn)為有序狀態(tài)，Trp19基團(tuán)向 Arg124運(yùn)動(dòng)，熒光強(qiáng)度被部分猝滅，疏水基團(tuán)包埋，熒光強(qiáng)度降低。并且，加工蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，二硫鍵Cy

4、s106-Cys119可能發(fā)生斷裂，既增強(qiáng)了巰基含量又有利于蛋白聚合。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定加工β-乳球蛋白與IgG的結(jié)合，結(jié)果顯示結(jié)合能力明顯降低，蛋白的部分抗原決定簇被破壞，降低了蛋白抗原性。
　　3.選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KU812細(xì)胞（l.0×l06個(gè)/mL）進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)評(píng)估實(shí)驗(yàn)，檢測(cè) KU812細(xì)胞脫顆粒釋放的生物活性介質(zhì)：β-HEX、組胺、TNF-α、IL-6以及胞內(nèi)Ca2+濃度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)原蛋白組檢測(cè)到的活性物質(zhì)含量最

5、高，外鈣內(nèi)流現(xiàn)象最明顯。Western Blot法檢測(cè)KU812細(xì)胞激發(fā)后信號(hào)通路的Lyn、Syk、NF-κB以及 MAPK家族蛋白的表達(dá)情況，原蛋白組信號(hào)通路上游和下游的磷酸化蛋白含量都最高，而加工蛋白的磷酸化程度較低。上游信號(hào)通路的源頭激酶Lyn、Syk被抑制可以進(jìn)一步抑制下游通路蛋白，從而抑制整個(gè)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被抑制導(dǎo)致新合成的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量降低。同時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)蛋白證實(shí)牛乳過(guò)敏可以由IgE