二黃糖腎康對(duì)糖尿病腎病大鼠細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是造成糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病腎病病變初期表現(xiàn)為腎小球和腎臟體積增大，隨著病程的進(jìn)展出現(xiàn)腎小球結(jié)節(jié)狀硬化，腎小管萎縮。近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)步，認(rèn)為細(xì)胞凋亡參與了糖尿病狀態(tài)下腎臟細(xì)胞由增生到萎縮的變化過程。細(xì)胞凋亡受多種因素調(diào)控，其中：Bcl-2和Bax是一組凋亡相關(guān)基因，對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)控作用。 我院腎病研究室采

2、用益氣扶正，活血降濁，補(bǔ)脾益腎的二黃糖腎康(黃芪、大黃、黨參、寄生、水蛭、茯苓、鬼箭羽等)治療本病，取得了較好的療效。我們以單側(cè)腎切除加腹腔注射鏈脲佐霉素(STZ)誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病模型為研究對(duì)象，動(dòng)態(tài)觀察了二黃糖腎康對(duì)糖尿病腎病大鼠。腎臟功能、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討二黃糖腎康的作用機(jī)制，尋求防治DN的有效方藥。 方法：SD大鼠60只，隨機(jī)抽取10只大鼠暴露右側(cè)腎臟后縫合，作為假手術(shù)組(

3、sham-operation group，SO)。其余50只大鼠行右腎切除術(shù)，2周切口愈合后，按50mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(溶于0.1mol/L，Ph=4.5的枸椽酸鈉緩沖液中)。48h后尾尖取血，測(cè)定血糖；取尿測(cè)尿糖及尿蛋白。血糖≥16.7mol/L，尿糖+++～++++，尿蛋白陽(yáng)性者確定為模型。取40只成模大鼠隨機(jī)分為模型組(M)、貝那普利治療組(B)，二黃糖。腎康低劑量治療組(EL)、二黃糖腎康高劑量治療組(EH)、加假手術(shù)

4、組，共五組，每組10只。給藥8周，最后一次給藥后，禁食8小時(shí)，稱重，斷頭取血，分離血清測(cè)尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血糖(GLU)、胰島素(INS)。無(wú)菌操作取左腎，去掉包膜稱重，固定腎組織，以備病理組織觀察、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)及原位末端標(biāo)記檢測(cè)。 結(jié)果： 1、二黃糖腎康對(duì)DN大鼠BUN、Scr的影響B(tài)UN：M組(14.22±3.03)明顯高于SO組(3.91±1.77)(p<0.01)；治療組與M組相比下

5、降，有顯著性差異(p<0.01)。EL組(6.19±0.85)、EH組(5.26±0.74)與B組(9.69±1.69)比較亦有顯著性差異(p<0.01)；EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)。 Scr：M組(187.78±24.55)明顯高于S0組(71.24±13.06)(p<0.01)；治療組與M組相比下降，有顯著性差異(p<0.01)；治療組之間無(wú)差異(p>0.05)。 2、二黃糖腎康對(duì)DN大鼠INS、GLU的

6、影響INS：M組(35.69±8.71)明顯高于S0組(11.78±2.54)(p<0.01)；治療組與M組相比下降，有顯著性差異(p<0.01)；EH組(11.33±1.91)與B組(17.59±2.67)相比有差異(p<0.05)，中藥治療組間無(wú)差異(p>0.05)。 GLU：M組(16.35±1.31)明顯高于SO組(6.20±0.79)(p

7、±0.94)與B組(8.44±1.35)比較差異顯著(p<0.05)，EH組(5.57±0.88)與B組比較有顯著差異(p<0.01)，EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)。 3、二黃降濁湯對(duì)DN大鼠KW/BW的影響KW/BW：M組(0.0112±0.0055)明顯高于SO組(O.0028±0.0002)(p<0.01)；治療組與M組相比下降，有顯著性差異(p<0.01)；EH組(0.0032±0.0002)與B組(0.00

8、64+0.0009)相比有差異(p<0.05)，EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)。 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎皮質(zhì)細(xì)胞凋亡 4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期G<,0>/G<,1>期：M組(49.27±9.3 1)明顯低于SO組(72.67±1.53)(p<0.01)；B組(61.10±2.80)較M組升高(p<0.05)，EL組(65.93±7.34)、EH組(72.10±2.69)較M組明顯升高(p<0.01)；EH組與B

9、組比較有差異(p<0.05)，EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)；B組與SO組比較有差異(p<0.05)。 S期：M組(30.32±7.44)明顯高于SO組(12.07±1.69)(p<0.01)；B組(21.13±6.64)較M組降低(p<0.05)，EL組(17.08±2.22)、EH組(11.93±2.10)較M組明顯降低(p<0.01)；EH組與B組比較有差異(p<0.05)，EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)；

10、B組與SO組比較有差異(p<0.05)。 G<,2>M期：各組之間相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 PI：M組(0.50±0.08)明顯高于SO組(0.27±0.15)(p<0.01)；B組(0.39±0.03)較M組降低(p<0.05)，EL組(0.34±0.07)、EH組(0.28±0.03)較M組明顯降低(p<0.01)；EH組與B組比較有差異(p<0.05)，EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)；B組與SO

11、組比較有差異(p<0.05)。 4.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率M組(13.98±1.74)細(xì)胞凋亡率明顯高于其余各組(p<0.01)；B組(7.58±1.08)細(xì)胞凋亡率高于SO組(4.17±0.77)(p<0.01)，EL組(6.34±0.95)高于SO組(p<0.05)；EH組(5.24±0.44)與B組比較有差異(p<0.05)，EL組、EH組間無(wú)差異(p>0.05)。 4.3流式細(xì)胞術(shù)檢Bcl-2及Bax相對(duì)含量

12、Bcl-2相對(duì)含量：M組(0.83+0.16)明顯低于S0組(1.00±0.14)(p<0.01)；B組(1.07±0.11)與M組比較有差異(p<0.05)，EL組(1.14±0.05)、EH組(1.18±0.15)與M組比較有顯著性差異(p<0.01)；治療組間無(wú)差異(p>0.05)。 Bax相對(duì)含量：M組(1.43±0.19)明顯高于SO組(1.00±0.05)(p<0.01)；B組(1.13±0.05)與M組比較有差異(

13、p<0.05)，EL組(1.11±0.13)、EH組(1.08±0.09)與M組比較有顯著性差異(p<0.01)；治療組間無(wú)差異(p>0.05)。 5、免疫組化法檢測(cè)Bcl-2及Bax的表達(dá)Bcl-2平均光密度：M組(0.098±0.01)明顯低于SO組(0.139±0.02)(p<0.01)；B組(0.116±0.01)與M組比較有差異(p<0.05)，EL組(0.122±0.01)、EH組(0.128±0.01)與M組比較有

14、顯著性差異(p<0.01)；治療組間無(wú)差異(p>0.05)。 Bax平均光密度：M組(0.140+0.04)明顯高于SO組(0.088+0.01)(p<0.01)；B組(0.101±0.01)較M組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，EL組(0.100±0.01)、EH組(0.091±0.01)與M組比較有顯著性差異(p<0.01)；治療組間無(wú)差異(D>0.05)。 6、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡SO組(0.05±0.02)大鼠

15、腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞極少，治療組'腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于M組(0.58±0.03)(p<0.01)；B組(0.39±0.12)、EL組(0.38±0.17)、EH組(0.27±0.05)之間無(wú)差異(p>0.05)。 M組(12.23±0.32)腎小管內(nèi)細(xì)胞凋亡率明顯高于SO組(3.72±0.25)(p<0.01)；治療組腎小管內(nèi)細(xì)胞凋亡率明顯少于M組(p<0.01)；EH組(5.46±0.11)與B組(8.87±0.23)比較有

16、顯著差異(p<0.05)；EL組、EH組間無(wú)明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論： 1、二黃糖腎康能夠降低尿素氮、血肌酐、血糖；增強(qiáng)胰島素生物活性，降低高胰島素血癥；降低。腎重/體重。 2、二黃糖腎康能夠減少腎臟細(xì)胞凋亡的數(shù)目。 3、二黃糖。腎康能夠干預(yù)細(xì)胞周期G<,0>/G<,1>、G<,2>M和S期，降低PI，從而減少細(xì)胞的過度增殖。 4、二黃糖腎康能夠調(diào)節(jié)：Bcl-2和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)，從而