dsRNA介導(dǎo)的RNAi沉默煙曲霉菌毒力相關(guān)基因arp1和nudC的研究.pdf

1、煙曲霉菌是存在于空氣中常見的腐生絲狀真菌病原體，其傳播方式為向空氣中釋放分生孢子，分生孢子為灰綠色，直徑僅為2-3μМ，極易進(jìn)入肺泡，據(jù)估計(jì)每人每天吸入幾百的煙曲霉菌分生孢子。其致病性依賴于宿主的免疫狀態(tài)，在免疫活性個(gè)體中，由于宿主的免疫系統(tǒng)可以將其滅活而很少引起疾病，然而，當(dāng)它感染免疫缺陷病人時(shí)，如器官移植術(shù)后，白血病，HIV感染等，可引起侵襲性煙曲霉菌病(Invasive Aspergillosis, IA),死亡率高達(dá)85％。在過

2、去的十年里，隨著免疫受損病人的增加和免疫抑制治療的廣泛使用，并由于該感染診斷的困難和缺乏高效低毒的抗真菌治療措施，侵襲性煙曲霉菌病的發(fā)病率甚至已經(jīng)超過了最常見的真菌感染—侵襲性念珠菌病，而成為主要的機(jī)會(huì)病原性真菌。 煙曲霉菌基因組序列測序已經(jīng)完成，功能基因組學(xué)方法可以利用這些信息識(shí)別所有潛在的藥物作用靶位，這就要通過對這些病原性菌株進(jìn)行基因?qū)W操作，識(shí)別毒力因子，分析表型變化。識(shí)別煙曲霉菌生命必需基因是發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物的第一步。

3、分子生物學(xué)的高速發(fā)展為病原微生物功能基因研究提供了豐富的技術(shù)，如體內(nèi)表達(dá)技術(shù)( in vivo expression technology,IVET)、差異熒光誘導(dǎo)(differential fluorescence induction, DFI)等正向篩選鑒定方法，轉(zhuǎn)座子Tn5介導(dǎo)的逆向遺傳突變(transpoton Tn5-basedreverse genetic mutation) 和信號標(biāo)簽突變(Signature-tagged

4、mutagenesis，STM)等反向鑒定技術(shù)，另外，還有差減雜交、差異顯示等方法。 目前已有多種技術(shù)用于了解煙曲霉菌基因功能。雖然利用這些技術(shù)在煙曲霉菌功能基因，包括毒力相關(guān)基因的篩選上取得了一些有價(jià)值的研究成果，但是，充分發(fā)掘和利用全基因組信息無疑將會(huì)大大加深該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。 雙鏈RNA 介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程稱為RNA 干涉(RNAinterference ， RNAi) 。RNAi 是指在多種生

5、物細(xì)胞內(nèi)，由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)同源序列mRNA 的特異性降解，而導(dǎo)致的基因沉默(gene silencing)現(xiàn)象。因RNAi 所導(dǎo)致的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，所以被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。RNAi 具有特異性和高效性特點(diǎn)，它作為新興的基因阻斷技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于基因功能及基因治療的相關(guān)研究。Liu 等人

6、在新型隱球菌中應(yīng)用RNAi 技術(shù)，構(gòu)建以pACT 為啟動(dòng)子，靶基因正反雙向序列被250bpGFP 序列隔開的發(fā)夾結(jié)構(gòu)載體，沉默靶基因，掀開了在真菌研究中應(yīng)用RNAi 技術(shù)的新篇章。研究者在真菌粗糙鏈孢霉中識(shí)別了三個(gè)基因具有RNAi 沉默分子機(jī)制： 一是QDE1，它與在西紅柿中發(fā)現(xiàn)的RNA 依賴的RNA 聚合酶相似；二是QDE2與RDE1 同源，RDE1 是秀麗線蟲中雙鏈的DNA 干涉所必需的；三是QDE3，它是RecQ DNA

7、解螺旋酶家族的成員。煙曲霉菌數(shù)據(jù)庫http://tigrblast.tigr.org\ufmg\中可查到與它們同源的蛋白， blastscore 分別是6×10-122,2×10-65,3×10-154,由此可見，煙曲霉菌中可能存在RNAi 機(jī)制， RNAi 可用于研究煙曲霉菌基因功能。 本研究應(yīng)用dsRNA 介導(dǎo)RNAi 特異性沉默煙曲霉菌色素形成相關(guān)基因arp1，初步探討了RNAi 在煙曲霉菌基因功能研究中的應(yīng)用；并且，運(yùn)用

8、該方法研究煙曲霉菌生命必需基因nudC，進(jìn)一步證實(shí)了nudC 基因?yàn)闊熐咕匦杌颉?第一部分dsRNA 介導(dǎo)的RNAi 沉默煙曲霉菌色素形成相關(guān)基因arp1 的研究： arp1基因編碼一種脫水酶，該酶在灰綠色真菌的二羥基萘黑色素形成路徑中發(fā)揮作用，沉默arp1 基因產(chǎn)生灰白色的分生孢子，其可有助于人補(bǔ)體C3在分生孢子上的沉積，而有力于吞噬細(xì)胞吞噬吸入人體的分生孢子。采用液氮研磨煙曲霉菌，提取總RNA，用含T7 啟

9、動(dòng)子序列的特異引物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出兩端含T7 啟動(dòng)子序列的arp1 基因。為了計(jì)算轉(zhuǎn)化率，合成了5’-FAM 標(biāo)記的siRNA 并用其電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌。以測序正確的兩端含T7啟動(dòng)子序列的arp1 基因片段為模版使用MEGAscript RNAi Kit 體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA，用合成的dsRNA 電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌后，觀察煙曲霉菌表型變化，RT-PCR 分析mRNA 變化。結(jié)果：5’-FAM 標(biāo)記的siRNA-arp1 電穿孔轉(zhuǎn)化煙區(qū)

10、霉菌12h 后，經(jīng)熒光倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，每次成功轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到50％～55％；以dsRNA 電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌后，轉(zhuǎn)化菌的arp1 基因mRNA 水平降低，轉(zhuǎn)化菌，陰性對照（mock 和無關(guān)dsRNA 對照）與18srRNA的比值分別為0.58±0.07；1.10±0.05；1.05±0.10，有顯著性差異（P<0.05）;并且，轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)生與母代綠色菌株不同的灰色菌株,類似基因敲除的表型。 第二部分dsRNA 介導(dǎo)的

11、RNAi 沉默煙曲霉菌nudC 基因的研究： nudC基因在構(gòu)巢曲霉中是生命必需基因，它參與多種細(xì)胞功能如核移位，細(xì)胞壁沉積。采用同研究arp1 基因相同的方法擴(kuò)增nudC 基因，以序列正確的線性nudC 基因片段為模版，使用MEGAscript? RNAi Kit 體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA，用合成的dsRNA 電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌后，觀察煙曲霉菌表型變化，RT-PCR分析mRNA 變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)化后，可見轉(zhuǎn)化菌生長受到明顯抑制，而陰性

12、對照菌株生長正常。相差顯微鏡下可見陰性對照菌絲萌芽生長，而轉(zhuǎn)化菌孢子腫脹，菌絲生長抑制；轉(zhuǎn)化菌的nudC 基因mRNA 水平降低，與18srRNA 的比值為0.50±0.07，顯著低于mock 和無關(guān)dsRNA 對照與18srRNA 的比值，1.09±0.06，1.10±0.09（F=9.38， P＜0.05）。 總之，煙曲霉菌色素形成相關(guān)基因arp1 和煙曲霉菌nudC 基因均為煙曲霉菌毒力相關(guān)基因。本研究用體外轉(zhuǎn)錄制備dsR