利用dsRNA誘導(dǎo)蚜蟲傳毒相關(guān)蛋白基因沉默以阻斷馬鈴薯Y病毒傳播的研究.pdf

1、大部分植物病毒通過與其傳播介體互作而實(shí)現(xiàn)水平傳播。煙蚜(Myzuspersicae)RPS2蛋白是一種核糖體蛋白，研究證實(shí)，RPS2在煙蚜傳播馬鈴薯Y病毒時(shí)起了重要作用。
　　 利用GenBank查找已報(bào)道的煙蚜RPS2蛋白序列，進(jìn)而得到煙蚜RPS2基因序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增得到了煙蚜RPS2基因的cDNA全長(zhǎng)序列。將煙蚜RPS2基因的cDNA全長(zhǎng)序列連接到PGEM-TeasyVector上并轉(zhuǎn)入

2、大腸桿菌(E.coli)NM522菌株中擴(kuò)增并保存，再以RPS2基因的cDNA全長(zhǎng)序列為模板，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增RPS2基因全長(zhǎng)序列的前段、中段和末段三個(gè)不同片段的引物，PCR擴(kuò)增得到三段RPS2基因的部分片段，分別命名為RPS2-1、RPS2-2和RPS2-3。同時(shí)為了構(gòu)建載體在三個(gè)片段兩端分別引入不同的酶切位點(diǎn)，RPS2-1片段的5'端和3'端分別引入了EcoRI和HindⅢ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，而RPS2-2和RPS2-3兩個(gè)片段的

3、5'端和3'端分別引入了EcoRI和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。通過酶切、連接等常用的分子實(shí)驗(yàn)方法，將三個(gè)片段分別連接到LITMUS-28i質(zhì)粒上，構(gòu)建成三個(gè)含RPS2基因片段的dsRNA原核表達(dá)載體。載體通過PCR，酶切以及測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體與預(yù)期相同。
　　 將三種重組載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)HT115(DE3)菌株內(nèi)，由于LITMUS-28i質(zhì)粒上存在兩個(gè)反向的T7啟動(dòng)子，同時(shí)大腸