黃河鯉TLR家族成員對(duì)LPS的響應(yīng)模式和TLR4a-TLR4b基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus）是河南重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。近年來(lái)，隨著黃河鯉高密度集約化養(yǎng)殖模式的不斷發(fā)展，其病害問(wèn)題日益嚴(yán)重，給漁業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大損失。因此，黃河鯉免疫和疾病防控對(duì)于黃河鯉養(yǎng)殖具有重要意義。弄清黃河鯉對(duì)病原的識(shí)別和響應(yīng)是有效防控疾病的重要內(nèi)容之一。Toll樣受體（Toll-like receptors, TLRs）作為一種重要的模式識(shí)別受體，可以特異性識(shí)別保守型的病原體相關(guān)分子模式，在

2、魚(yú)類(lèi)的病原識(shí)別和啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著及其重要的作用。脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，也稱(chēng)為內(nèi)毒素，是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)爆發(fā)細(xì)菌性疾病的主要毒力因子之一。但在黃河鯉中，模式識(shí)別受體對(duì)LPS的免疫應(yīng)答缺乏系統(tǒng)研究。因此，弄清黃河鯉TLRs對(duì)LPS的免疫響應(yīng)模式及關(guān)鍵基因TLR4a/TLR4b的分子特征及表達(dá)變化，對(duì)黃河鯉的疾病防控具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　本文根據(jù)GenBan

3、k數(shù)據(jù)庫(kù)中鯉TLRs部分序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)鯉18種TLRs表達(dá)量，注射不同濃度（2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL）LPS后，檢測(cè)黃河鯉肝中18種TLRs在不同時(shí)間（3 h、6 h、12 h、1 d、2 d和3 d）的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，TLR1、TLR4a、TLR4b、TLR5M、TLR20和TLR22的表達(dá)量明顯上調(diào)；TLR3、TLR18、TLR19和TLR25表達(dá)量下調(diào)；TLR7家族成員（TLR7

4、、TLR8和TLR9）、TLR2和TLR21表達(dá)量在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。本研究是對(duì)黃河鯉 LPS刺激后所有己知TLRs家族成員表達(dá)模式的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)TLRs家族不同成員對(duì)LPS刺激表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。
　　本研究發(fā)現(xiàn)TLR4a和TLR4b對(duì)LPS應(yīng)激顯示明顯響應(yīng)，為此，對(duì)TLR4a和TLR4b的分子結(jié)構(gòu)特征和對(duì)LPS響應(yīng)的表達(dá)變化進(jìn)行研究。采用RT-PCR和RACE方法，獲得黃河鯉TLR4a和TLR4b基因全長(zhǎng)cDNA序列

5、，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及同源性分析，結(jié)果顯示：①黃河鯉TLR4a cDNA全長(zhǎng)2836 bp，包含開(kāi)放閱讀框（ORF）2325 bp，編碼794個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)123 bp和3’非編碼區(qū)388 bp。在線預(yù)測(cè)TLR4a蛋白相對(duì)分子量為121.5 kD，理論等電點(diǎn)為5.73；包含6個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域，1個(gè)LRR-CT基序，1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)TIR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。②TLR4b cDNA全長(zhǎng)序列為2897 bp，包含2466 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼

6、821個(gè)氨基酸，198 bp的5’非翻譯區(qū)和233 bp的3’非翻譯區(qū)。在線預(yù)測(cè) TLR4b蛋白相對(duì)分子量為123.1 kD，理論等電點(diǎn)為5.81；包含8個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域，1個(gè)LRR-CT基序，1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)TIR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。③對(duì)不同魚(yú)類(lèi)中氨基酸全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明TLR4a和TLR4b在魚(yú)類(lèi)中高度保守，推測(cè)其在魚(yú)類(lèi)中扮演重要的生物學(xué)功能。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，黃河鯉TLR4a和TLR4b與斑馬魚(yú)（Danio rerio） TL

7、R4a和TLR4b親緣關(guān)系最近。
　　采用半定量PCR方法檢測(cè)黃河鯉不同組織器官中TLR4a和TLR4b表達(dá)量。黃河鯉TLR4a和TLR4b在12種組織器官（肝、脾、腎、頭腎、腦、鰓、鰭、肌肉、腸道、心臟、血液和皮膚）中均可檢測(cè)到表達(dá)。TLR4a和TLR4b均是在脾和頭腎中表達(dá)量最高，血液和肌肉中表達(dá)量最低。RT-qPCR檢測(cè)3種濃度（2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mLl） LPS注射后不同時(shí)間點(diǎn)（3 h、6 h、12

8、 h、1 d、2 d和3 d）黃河鯉TLR4a和TLR4b在鰓、肝、脾和頭腎中的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS注射后，肝、脾和頭腎中 TLR4a和 TLR4b表達(dá)量明顯上調(diào)，但是，在鰓中TLR4a和TLR4b表達(dá)量無(wú)明顯變化。在脾和頭腎中，TLR4a和TLR4b均在高濃度組（8 mg/mL）注射6 h后達(dá)到了最高值。然而，在肝中，TLR4a和TLR4b在低濃度組（2 mg/mL）上調(diào)最顯著，在6 h分別達(dá)到了對(duì)照組的28.64倍和25.39倍