異羥肟酸類組蛋白去乙酰化酶抑制劑N25的合成及體外抗腫瘤作用研究.pdf

1、大量的研究已證實表觀遺傳學變化對于癌癥的發(fā)展發(fā)揮著關鍵作用,組蛋白乙?；揎椬鳛楸碛^遺傳學其中一個重要的組成部分,也是目前國際研究的熱點。它通過組蛋白乙?；D移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs)共同調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；癄顟B(tài),影響著染色質(zhì)的結構和基因的轉錄,從而進一步影響著細胞增殖、細胞周期、凋亡等。因此,由HDACs為作用靶點發(fā)展起

2、來的組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylases inhibitor,HDACi)成為一類很有前景的抗腫瘤藥物?，F(xiàn)今不同結構類型的HDACi已被合成,并應用于體外的抗腫瘤實驗或是臨床研究應用中。本課題基于異羥肟酸類HDACi與HDACs的構效關系特點,以SAHA為先導化合物,結構修飾得到N-(2,5-二甲氧基苯基)-N′-羥基辛二酰胺(簡稱N25)。以膠質(zhì)瘤細胞株和肺癌細胞株作為本實驗研究對象,驗證其對HDACs和組

3、蛋白乙?；挠绊?以及通過體外藥效學方法評價N25的抗腫瘤作用及探討相關機制。
　　目的:將異羥肟酸類HDACi中SAHA進行結構修飾,改造出新化合物N25。考察N25的體外抗腫瘤活性,以及對HDACs和組蛋白乙?；绊?。在此基礎上,進一步考察其對細胞周期及細胞周期相關因子、細胞凋亡誘導的影響。旨在探討N25作為SAHA衍生物能否以HDACs為靶點,改變組蛋白的乙?；?及其發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制。
　　方法:①根據(jù)異羥

4、肟酸類HDACi與HDACs的構效關系特點,以SAHA為先導化合物,在其表面識別區(qū)采用2,5-二甲氧基苯基代替苯基修飾成N25,參考SAHA的合成路徑將其合成。采用三氯化鐵溶液的顏色鑒別異羥肟酸基團,紅外光譜、核磁共振氫譜分別對其主要官能團、結構進行鑒定,質(zhì)譜測定其分子量。
　?、谝匀四X膠質(zhì)瘤U251、U87、T98G細胞株和人肺癌H460、A549、H1299細胞株為研究對象,采用CCK-8法,考察N25和SAHA對兩種類型的腫

5、瘤細胞株在7個給藥濃度0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μMol/L,作用48h的抑制效果,并計算其半數(shù)抑制濃度(IC50),從不同類型的腫瘤細胞株中篩選出敏感細胞株,用于后續(xù)實驗。
　?、踂estern Blot檢測N25對U251、H460細胞中HDACs和組蛋白的乙酰化影響;
　?、懿捎昧魇郊毎g,PI單染法檢測N25對U251、H460細胞的細胞周期影響;
　?、軷T-PCR檢測N25對

6、U251、H460細胞的細胞周期相關因子mRNA表達影響;
　?、薏捎昧魇郊毎g,Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測N25誘導U251、H460細胞產(chǎn)生凋亡的影響。
　　結果:①合成得到類白色粉末,經(jīng)三氯化鐵醇溶液的顏色鑒定顯紫紅色,紅外光譜鑒別出羰基、羥基、苯環(huán)、甲氧基等主要官能團,質(zhì)譜結果表明樣品的分子量為324.1774g/mol,核磁共振氫譜的信息反映的是N25的氫原子信號。
　　②N25和SAHA對3株

7、膠質(zhì)瘤細胞和3株肺癌細胞均表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用,且呈現(xiàn)劑量依賴性。N25對U251、U87、T98G膠質(zhì)瘤細胞的半數(shù)抑制率IC50值分別為:6.280±0.894(μMol/L)、11.332±0.505(μMol/L)、15.435±1.000(μMol/L)。而SAHA對這3株細胞相應的IC50值分別是:6.322±1.271(μMol/L)、6.407±0.075(μMol/L)、10.035±2.004(μMol/L)。N2

8、5對U251細胞的抗增殖作用稍強于SAHA,而U87、T98G細胞對SAHA的敏感性卻強于N25。在H460、A549、H1299肺癌細胞中,N25對H460、A549、H1299細胞的IC50值分別為:2.443±0.314(μMol/L)、3.463±0.841(μMol/L)、2.933±0.642(μMol/L)。而SAHA對其相應的IC50值分別為:5.163±0.973(μMol/L)、7.203±1.285(μMol/L)

9、、6.869±1.132(μMol/L)。N25對H460、A549、H1299細胞的生長抑制作用均強于SAHA,其中N25對H460的細胞殺傷作用最為敏感。
　?、跱25顯著地減少U251、H460細胞中HDAC4蛋白的表達水平,并提高組蛋白H3(K9+K14+K18+K23+K27)的總體乙?；胶虷3-K9單一位點的乙?；健25抑制HDAC4表達和上調(diào)組蛋白H3乙?；饔镁鶅?yōu)于SAHA。
　?、躈25作用U25

10、1細胞24h,對UG0/G1期為顯著性下調(diào)(P?0.001),對S期也略有下調(diào),而G2/M期的細胞比例則明顯增加(P?0.001),將細胞周期阻滯于G2/M期。延長作用時間為48h,其細胞周期則被阻滯于G0/G1期,而S、G2/M期的細胞比例均為下降(P?0.01),其中APO比例偏大提示N25能誘導U251細胞凋亡。N25處理H460細胞48h,出現(xiàn)細胞周期停滯于G2/M期,G0/G1、S期細胞所占比例均有所下降,各個劑量組對APO的

11、影響較小。
　?、軳25分別上調(diào)U251、H460細胞的P21WAF1/CIP1基因表達,而P53基因,卻呈下調(diào)趨勢表達,這與SAHA得到的作用結果相似。
　　⑥N25能夠顯著地誘導U251、H460細胞產(chǎn)生凋亡。U251細胞中,與陰性對照組(1.1±0.3)相比,N25的低劑量組(47.5±0.5)、中劑量組(64.2±7.1)、高劑量組(69.5±10.6)、SAHA(63.7±4.2),均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.001

12、)。細胞凋亡出現(xiàn)在早期和中、晚期都比較顯著,但更主要是出現(xiàn)于中、晚期的凋亡。在H460的細胞凋亡中,與陰性對照組(0.2±0.1)比較,N25低劑量組(28.4±2.5)、中劑量組(32.0±4.9)、高劑量組(32.4±5.6)、SAHA(30.3±3.4),均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.001),且絕大多數(shù)的凋亡細胞出現(xiàn)于早期(P<0.001),僅有少數(shù)出現(xiàn)于中、晚期。
　　結論:①成功合成N25,屬于SAHA的衍生物。
　

13、　②N25對人腦膠質(zhì)瘤U251、U87、T98G細胞株和人肺癌H460、A549、H1299細胞株具有顯著的生長抑制作用,其抗增殖效果呈劑量依賴關系。
　　③N25明顯減少U251、H460細胞中HDAC4蛋白表達,并提高組蛋白H3的乙?；?說明其作用靶點有可能為HDAC4,可作為潛在的組蛋白去乙?；敢种苿?br>　?、躈25作用U251、H460細胞時間分別為24、48h時,細胞周期均被阻滯于G2/M期,當作用U251細