亞硝酸降解與PMP衍生LC-MS聯(lián)用技術在糖胺聚糖結構解析以及相關藥物質(zhì)量控制中的應用研究.pdf

1、糖胺聚糖是一大類由糖胺或含糖胺的二糖作為基本重復單元組成的線性多糖，包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、甲殼素及甲殼胺等。肝素及硫酸乙酰肝素由不同程度及位點的O-磺酸、N-乙酰/磺酸修飾的氨基葡萄糖和糖醛酸二糖組成。硫酸軟骨素及硫酸皮膚素則由O-磺酸修飾的N-乙酰氨基半乳糖和糖醛酸組成。透明質(zhì)酸的二糖重復單元是沒有磺酸修飾的N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸。硫酸角質(zhì)素不含糖醛酸，主要由磺酸修飾的半乳糖和氨

2、基葡萄糖二糖組成。年產(chǎn)量達億噸的甲殼素是由N-乙酰氨基葡萄糖組成的多聚糖，其脫乙酰產(chǎn)物甲殼胺因為具有良好的理化性質(zhì)而倍受關注。
　　從動物組織提取的肝素是臨床上已使用了近80年的的抗凝血藥物，也是世界上產(chǎn)量和銷售額最大的糖類藥物。近年來肝素類藥物的銷售量以每年20％的速度遞增，2009年全球肝素類藥物的銷售額已達69億美金。從動物組織或軟骨提取的硫酸軟骨素廣泛被關節(jié)炎病人服用。在美國的非處方藥物中，硫酸軟骨素的銷售額位居第二。中國

3、也是硫酸軟骨素的主要出口大國，但除了硫酸軟骨素A作為藥用外，其它結構硫酸軟骨素仍沒有進入藥典。透明質(zhì)酸不僅因其保濕性用于美容，還具有很好的組織相容性而在眼科顯微手術、藥物釋放及組織工程領域廣泛應用。近20年研究發(fā)現(xiàn)，甲殼胺以及甲殼胺衍生物具有一些如抗菌，免疫刺激，降血脂，甚至有抗癌作用，目前在世界范圍內(nèi)有37項甲殼胺作為藥物的臨床研究。
　　糖胺聚糖類藥物和其它藥物的不同在于其靶點大多存在于細胞之外，不僅參與血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)

4、及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，而且參與細胞的粘附、識別以及信號的轉導等，其安全性高、毒性低以及特異性強的特性使其成為本世紀藥物開發(fā)的熱點。然而，由生物合成的糖胺聚糖結構、分子量及磺化度多變難控，作為藥物其質(zhì)量控制是一個長期解決不了的問題，因此嚴重阻礙了糖胺聚糖類藥物的研究與開發(fā)。
　　表征動物來源糖胺聚糖結構的主要手段是酶降解產(chǎn)生二糖，然后使用各種分析手段對酶降解產(chǎn)生的二糖進行與二糖標準品的對比分析。這些方法的科學性建立在裂解酶可以完全將糖胺聚

5、糖降解為二糖，不存在不能被酶降解的片段。但是生物酶產(chǎn)品質(zhì)量控制，保存不當都會導致活性差異，進而無法保證糖鏈被全部降解成為可供分析的二糖，每次操作的差異性不可避免。更重要的是糖胺聚糖結構復雜，幾乎所有糖胺聚糖都存在不能被酶降解成為二糖的片段。
　　本論文針對所有糖胺聚糖都含有氨基糖為基本出發(fā)點，開發(fā)了一種可以用于結構解析和質(zhì)量控制的糖胺聚糖化學降解分析方法，這樣就可以擺脫酶解分析二糖中的一系列不可控因素。我們經(jīng)過實驗選擇使用亞硝酸降

6、解動物糖胺聚糖和甲殼胺。亞硝酸可以通過和糖鏈中的氨基糖，形成重氮鹽，重氮鹽的在水溶液環(huán)境不穩(wěn)定，容易形成穩(wěn)定程度更高的N2離去，重氮鹽碳原子缺電子受到糖環(huán)上C5位成環(huán)的O攻擊，可以形成新的五元糖環(huán)，隨之的是電子轉移到糖環(huán)的C1，導致糖苷鍵斷裂并形成新還原糖。亞硝酸降解產(chǎn)物可以和常用于糖類衍生的試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)以1:2的比例反應脫水形成具有強紫外吸收的糖-2PMP復合物，該復合物具有利于分離和檢測的特征，后續(xù)

7、可以使用高效液相分離檢測不同的糖-2PMP衍生物。糖胺聚糖可含葡萄糖胺(GlcN)或半乳糖胺(GalN，亞硝酸降解的產(chǎn)物分別是2，5脫水甘露糖(M)和2，5-脫水塔羅糖(T)。我們以葡萄糖胺的亞硝酸降解產(chǎn)物2，5脫水甘露糖為研究對象，優(yōu)化了亞硝酸降解產(chǎn)生M及最佳PMP衍生條件，從而進一步開發(fā)了糖胺聚糖、甲殼胺及衍生物的降解衍生方法。
　　亞硝酸降解的糖胺聚糖產(chǎn)物經(jīng)過HPLC分離電噴霧電離質(zhì)譜檢測，通過一些已知結構的化學合成糖胺聚糖

8、類似物如肝素五糖的亞硝酸降解產(chǎn)物，或是特殊脫硫產(chǎn)物來確定肝素/硫酸乙酰肝素的亞硝酸降解產(chǎn)物結構。還使用二級質(zhì)譜來分析亞硝酸降解產(chǎn)物結構，通過碎片離子判斷硫酸酯位于二糖中的糖胺還是糖醛酸，結合能水解糖醛酸的酶來消去部分亞硝酸降解二糖來確定其結構，通過這一系列確認結構手段的聯(lián)合使用，闡述了肝素類糖胺聚糖的亞硝酸降解產(chǎn)物的所有結構。運用亞硝酸降解分析市場上常見的低分子肝素（依諾肝素，那曲肝素，達納肝素），分析由不同制備方法生產(chǎn)的低分子肝素結構

9、上的差異，測試該方法的檢測靈敏度，檢測線性范圍等等。對比傳統(tǒng)肝素類結構解析和質(zhì)量控制方法，使用肝素酶ⅠⅡⅢ來降解肝素和低分子肝素并用傳統(tǒng)方法來分析我們實驗中所用的肝素/低分子肝素，驗證新開發(fā)用于肝素類結構解析，質(zhì)量控制方法的準確性，比較兩種方法的優(yōu)劣。分析硫酸軟骨素類糖胺聚糖，硫酸角質(zhì)素，硫酸乙酰肝素，必須先經(jīng)過脫乙酰處理得到能和亞硝酸反應的自由氨基，本文還對含有大量乙酰的糖胺聚糖進行脫乙酰反應優(yōu)化得到全脫乙酰糖胺聚糖進行亞硝酸降解得到

10、全部結構信息。
　　甲殼胺和甲殼素的差異在于糖鏈中的乙酰取代程度，乙酰度是甲殼胺質(zhì)量控制唯一參數(shù)。我們使用亞硝酸降解甲殼胺，其專一作用于無取代的氨基糖，不影響N-乙酰氨基葡萄糖。形成2，5脫水甘露糖，或是N-乙酰氨基葡萄糖-2，5脫水甘露糖寡糖，通過亞硝酸降解PMP衍生HPLC-UV分析，可以測算出乙酰度。使用傳統(tǒng)的乙酰測定方法如滴定/1H-NMR驗證得到一致結果。這一分析甲殼胺的方法還可以用于測定甲殼胺中的N-乙酰氨基葡萄糖的分

11、布，及聚合度，我們使用化學乙酰方法合成較高乙酰度的甲殼胺，經(jīng)過我們新開發(fā)的亞硝酸降解PMP衍生方法分析結果顯示其乙酰度上升寡糖聚合度可高達11，可見我們的甲殼胺分析方法可以作為甲殼胺質(zhì)量控制的指紋圖譜。合成甲殼胺的衍生物磺化甲殼胺，并使用亞硝酸降解PMP衍生HPLC分析，可以得到和13C-NMR一致的結構信息。
　　基于PMP在分析糖胺聚糖和甲殼胺類多糖中的重要作用，我們合成了兩種氘代PMP，以氘代乙酸為原料合成了1-苯基-3-甲

12、基(D3)-5-吡唑啉酮D3PMP，以氘代苯胺為原料合成了1-苯基(D5)-3-甲基-5-吡唑啉酮D5PMP.將兩種PMP同位素用于標記還原性糖，使用質(zhì)譜鑒定三種同位素質(zhì)量數(shù)差別，將PMP同位素用于質(zhì)譜定量，聯(lián)合亞硝酸降解分析不同廠家的低分子肝素差別，同位素標記對比分析豬組織心臟腎臟糖胺聚糖的差異。
　　小結:本文開發(fā)一種化學降解，PMP柱前衍生HPLC分析解析糖胺聚糖結構及糖胺聚糖質(zhì)量控制方法。使用本論文建立的脫乙酰、亞硝酸降解

13、聯(lián)合PMP柱前衍生方法分析糖胺聚糖二糖，擺脫了對價格較高的糖胺聚糖酶的依賴。此方法適用于各種糖胺聚糖的結構分析，不僅成本低，還具有同時分析糖胺聚糖混合物這一優(yōu)點。對于來源廣價格低的糖胺聚糖如甲殼胺類，在PMP衍生后的紫外檢測器就可以達到結構分析要求。我們新建立的方法還可以使用3種質(zhì)量數(shù)不同的PMP同時標記3種化學降解了的糖胺聚糖樣品，用色譜質(zhì)譜聯(lián)用定性定量比較3種混合進樣的糖胺聚糖結構上的相同與不同，從而為未來糖胺聚糖藥物開發(fā)與質(zhì)量控制