雞毒支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白和GroEL蛋白誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞釋放IL-1β的研究.pdf

1、雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，M.gallisepticum）屬于支原體屬，能夠引起雞慢性呼吸道?。–hronic respiratory disease，CRD）、氣囊炎和氣管炎。雞毒支原體能夠黏附到宿主表面，激活宿主體內(nèi)相關(guān)信號通路，造成宿主細(xì)胞損傷或凋亡。雞毒支原體無細(xì)胞膜，但其表面存在著大量脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)。許多研究

2、表明，LAMPs可以黏附到宿主細(xì)胞表面，激活宿主的天然免疫應(yīng)答，但是LAMPs如何激活宿主天然免疫應(yīng)答的具體機(jī)制尚未報道。
　　病原微生物入侵到動物體內(nèi)時，動物體首先啟動天然免疫反應(yīng)，產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答，進(jìn)而釋放相關(guān)炎癥因子起到抗感染的作用。在天然免疫應(yīng)答的研究中，NF-κB信號通路研究的最為廣泛，存在于動物細(xì)胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在此過程中起到識別作用。TLRs家族成員眾多，各自

3、能夠特異性識別配體，如TLR2和TLR4可以識別革蘭氏陽性菌表面的脂蛋白，激活下游信號分子，啟動數(shù)種信號通路并釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子，造成宿主細(xì)胞的損傷或凋亡。由于支原體LAMPs在結(jié)構(gòu)上與革蘭氏陽性菌表面的脂蛋白相似，所以本實驗旨在研究感染雞毒支原體后是否能夠激活NF-κB信號通路并引起IL-1β的釋放，并且驗證TLR2和MyD88在此過程中的作用。
　　雞毒支原體LAMPs為混合物，其中含有的許多膜蛋白具有較高免疫原性，但其中何種

4、蛋白能夠激活雞的天然免疫應(yīng)答目前尚未明確。在大腸桿菌的相關(guān)研究中證實，GroEL有較好的免疫原性。因此，研究雞毒支原體GroEL是否具有同樣的高免疫活性，是否可以激活雞的天然免疫應(yīng)答對雞毒支原體致病機(jī)制的研究具有重要意義。
　　為研究雞毒支原體LAMPs和GroEL誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞IL-1β釋放的機(jī)制，本研究以雞成纖維細(xì)胞(DF-1)為細(xì)胞模型，首先利用SYBR GreenⅠ Real-time PCR和ELISA方法檢測LAMP

5、s及GroEL蛋白刺激后的DF-1細(xì)胞中IL-1β的釋放量。結(jié)果表明:雞毒支原體的LAMPs及GroEL均能有效誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞釋放IL-1β，且IL-1β的釋放量呈時間和劑量梯度。為了檢測NF-κB信號通路是否被激活，本研究采用激光共聚焦檢測p65入核和Western blot技術(shù)檢測p65磷酸化水平。結(jié)果顯示:雞毒支原體LAMPs能夠有效誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞p65進(jìn)核，并且雞毒支原體LAMPs和GroEL均能使p65磷酸化水平提高，從而

6、確定雞毒支原體LAMPs和GroEL均能夠激活NF-κB信號通路。為明確MyD88和TLR2在此過程中的作用，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，抗體封閉方法使MyD88和TLR2過表達(dá)或沉默，檢測兩種情況下IL-1β表達(dá)情況。經(jīng)檢測顯示:過表達(dá)MyD88、TLR2組的IL-1β mRNA和蛋白水平顯著升高，而抗體封閉TLR2組和MyD88沉默組的IL-1β mRNA和蛋白水平下降。證實LAMPs能夠與DF-1細(xì)胞膜上的TLR2受體結(jié)合，并激活下游接頭分子M

7、yD88，從而有效誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞表達(dá)并分泌IL-1β。GroEL蛋白在大腸桿菌中具有較高的免疫原性，為了證明其在雞毒支原體激活宿主天然免疫應(yīng)答中的作用，本研究采用激光共聚焦檢測其黏附作用。結(jié)果表明:GroEL蛋白可以成功的黏附到DF-1細(xì)胞表面，這為GroEL蛋白發(fā)揮作用提供了基礎(chǔ)。為了確定雞毒支原體GroEL激活宿主天然免疫的機(jī)制，本研究采用蛋白互作技術(shù)手段，即GST pulldown和免疫共沉淀，明確其在DF-1細(xì)胞中的互作蛋白。