雞白細(xì)胞介素2基因與雞毒支原體H3株TM-1基因的串聯(lián)及原核表達(dá).pdf

1、為了提高雞毒支原體DNA疫苗的免疫效果，本研究運(yùn)用分子克隆技術(shù)，獲得了雞白細(xì)胞介素2基因，然后將其與雞毒支原體H3株TM-1基因進(jìn)行串聯(lián)構(gòu)建了融合基因，并在原核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。 首先，根據(jù)GenBank中已登錄的雞白細(xì)胞介素2cDNA序列以及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a的多克隆位點(diǎn)，自行設(shè)計(jì)引物，為了便于基因的克隆和表達(dá)，我們在引物的5’端和3’端設(shè)計(jì)了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)、保護(hù)位點(diǎn)、連接臂、起始密碼和終止密碼。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

2、應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從經(jīng)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)6h的雞脾淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增獲得了大小約為460bp的DNA片段，將其連接到pMD19-T質(zhì)粒上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒PCR．和雙酶切鑒定后，篩選獲得陽性重組克隆pMD19-T-IL-2。核苷酸序列測定分析表明，與GenBank中登錄的雞白細(xì)胞介素2cDNA序列一致，這表明已成功克隆了雞白細(xì)胞介素2基因。 其次，運(yùn)用DNA重組技術(shù)將雞白細(xì)胞介素2基因和雞毒支原體H3株TM-1基因進(jìn)行串聯(lián)，插

3、入到pET-30a質(zhì)粒的EcoRI和HindⅢ多克隆位點(diǎn)之間，經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測定，結(jié)果表明已成功構(gòu)建了含雞毒支原體H3株TM-1基因和雞白細(xì)胞介素2基因的融合基因，并將含有此融合基因的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-TM-1-IL-2。 最后，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株。經(jīng)IPTG-37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，融合蛋白得到了表達(dá)，分子量約為43kDa，主要以包涵體