C-EBPα基因表達(dá)對(duì)PARs激活HSC促肝纖維化形成的負(fù)性調(diào)控作用.pdf

1、肝纖維化是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，迄今沒(méi)有理想的治療方法。目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活是肝纖維化的關(guān)鍵，抑制HSC的激活對(duì)肝纖維化防治有重要作用。
　　 蛋白酶活化受體(protease activated receptors，PARs)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，與多種病理生理過(guò)程相關(guān)。我們前期有關(guān)PAR1.2調(diào)控HSC活化、增殖

2、作用研究提示：PAR1.2是凝血酶和胰蛋白酶介導(dǎo)的肝纖維化自動(dòng)放大循環(huán)過(guò)程中的主要炎癥和纖維化受體，其表達(dá)不僅可以促進(jìn)肝纖維化形成，還可以加重肝臟炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在肝纖維化形成中起著正性促進(jìn)作用。拮抗PAR1.2活性可以抑制HSC激活，阻斷膠原蛋白產(chǎn)生，還可以限制肝臟炎癥反應(yīng)，中斷肝纖維化過(guò)程中HSC激活后的自動(dòng)放大循環(huán)作用，但是至今在肝纖維化的防治研究中尚未發(fā)現(xiàn)有效的選擇性PAR1.2的抑制劑和方法。
　　 肝纖維化研究發(fā)現(xiàn)HS

3、C激活的顯著變化是細(xì)胞內(nèi)脂滴的減少甚至消失，脂滴的消失意味著去脂肪細(xì)胞分化，HSC向脂肪細(xì)胞分化是維持其靜止所必須，去脂肪細(xì)胞分化在HSC激活中起著關(guān)鍵作用。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白a(CCAAT enhancer bindingproteins a，C/EBPa)基因表達(dá)是維持脂肪細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，其主要功能是促進(jìn)脂肪細(xì)胞進(jìn)入終末分化，C/EBPα單獨(dú)表達(dá)增強(qiáng)足以誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3向脂肪細(xì)胞分化。目前已知肝組織中的肝細(xì)胞及

4、靜止的HSC中有C/EBPα的表達(dá)，活化的HSC中C/EBPα表達(dá)陰性，那么，與脂肪細(xì)胞分化脂滴形成相關(guān)的C/EBPα能否維持HSC靜止，引入C/EBPα維持脂肪細(xì)胞分化防止HSC激活機(jī)制對(duì)PARs促肝纖維化形成是否有負(fù)性調(diào)節(jié)作用？
　　 鑒于以上認(rèn)識(shí)，本研究擬在PAR1.2激活HSC促肝纖維化形成的正性調(diào)控基礎(chǔ)上，構(gòu)建C/EBPα載體并轉(zhuǎn)染經(jīng)PAR1.2激活的HSC，觀察C/EBPα阻止HSC激活并抑制肝纖維化形成作用，以期把

5、對(duì)PAR1.2的拮抗和上調(diào)C/EBPα表達(dá)引入HSC激活的負(fù)性調(diào)控機(jī)制中，為肝纖維化防治提供依據(jù)。
　　 本課題的主要結(jié)果和結(jié)論：
　　 1.HSC-T6保持了HSCs原始細(xì)胞學(xué)特征，激活的HSC-T6可以表達(dá)α-SMA并合成Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，能較好的反應(yīng)其在體內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程，是研究肝纖維化的理想細(xì)胞模型。
　　 2.雙酶切鑒定pcDNA3.1(-)-C/EBPα質(zhì)粒重組體，可完全切回至C/EBPα及pcDNA3

6、.1(-)載體分子量大小，表明此質(zhì)粒構(gòu)建成功，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。
　　 3.外源性C/EBPα基因可有效轉(zhuǎn)染HSC-T6，轉(zhuǎn)染后可高表達(dá)。上調(diào)C/EBPα表達(dá)在一定程度上可抑制HSC-T6活化及膠原蛋白的合成。
　　 4.將外源性C/EBPα引入到PAR1.2激活的HSC-T6細(xì)胞中，α-SMA及Ⅰ型前膠原的表達(dá)均下降，細(xì)胞增殖度也降低，提示：上調(diào)C/EBPα表達(dá)在一定程度上可抑制PAR1、2對(duì)HSC活化、增殖及分泌膠原