PGRN與CIP2A基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其對腫瘤侵襲性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的組織學(xué)類型，其發(fā)生率占所有膠質(zhì)瘤的75％以上。根據(jù)2007年WHO顱內(nèi)腫瘤的病理分級標(biāo)準(zhǔn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞共分為四級（Ⅰ級-Ⅳ級）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級)是發(fā)生率及惡性程度最高的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤。盡管顯微手術(shù)切除、術(shù)后放療、化療等綜合治療措施的廣泛應(yīng)用，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍舊很差，其中位生存期不足一年。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以腫瘤特異性表達(dá)基因譜為

2、基礎(chǔ)的分子靶向治療有可能為膠質(zhì)瘤的治療帶來新希望。因此，確定與膠質(zhì)瘤惡性進展相關(guān)并具有預(yù)后意義的分子對于實施有效的靶向治療具有重要意義。
　　 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，以高度的細(xì)胞分裂活性，明顯的微血管增生，及廣泛的浸潤生長為特征。生長因子的超表達(dá)在這些病理改變中起了非常重要的作用，如已知的血管生成因子（VEGF），肝細(xì)胞生長因子(HCG)，以及血小板衍生因子(PDGF)等等。PGRN(progranulin)即顆粒

3、蛋白前體，又稱為顆粒素-上皮素前體，鼠畸胎瘤PC細(xì)胞源性生長因子，是新近發(fā)現(xiàn)的一種多功能的生長因子，它持續(xù)高水平表達(dá)于組織的塑型與重構(gòu)過程，如胚胎的發(fā)育，傷口的修復(fù)，炎癥以及腫瘤組織的形成等等。以前的研究發(fā)現(xiàn)PGRN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如它可加速細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，促進細(xì)胞的遷移、侵襲行為等等。這些作用與它能夠激活PI3K/AKt、MAPK/ERK、FAK等生長因子相關(guān)通路有關(guān)。迄今為止，在多種腫瘤組織如卵巢癌、前列腺癌

4、、肝癌、骨髓瘤等均發(fā)現(xiàn)了PGRN的高水平表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，PGRN基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平比正常腦組織顯著升高。然而PGRN在各級星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)狀態(tài)、臨床意義、以及與腫瘤侵襲性的關(guān)系仍未見報道。本研究旨在明確PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況及其臨床意義，并對PGRN與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性的關(guān)系進行初步探討。
　　 目的：
　　 1.PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況
　

5、　 2.探討PGRN的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特征的關(guān)系及預(yù)后意義
　　 3.沉默PGRN的表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87、T98G細(xì)胞增殖的影響
　　 4.沉默PGRN的表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87、T98G細(xì)胞侵襲性的影響及分子機制
　　 方法：
　　 1.PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 ①臨床標(biāo)本收集:收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科2005-2009

6、年間新鮮手術(shù)標(biāo)本56例以及病理科石蠟包埋標(biāo)本154例。所有患者術(shù)前未行放療或化療治療。
　　 ②采用RT-PCR、Western Blot及免疫組化的方法檢測臨床標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251及T98G中PGRN的表達(dá)情況。
　　 2.PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中表達(dá)的臨床意義
　　 ①方差分析(ANOVA)比較PGRN在各病理級別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤之間的表達(dá)差異;卡方檢驗分析PGRN的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床

7、特征之間的關(guān)系;Kaplan-Meier生存曲線及Cox多因素回歸分析確定PGRN的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者預(yù)后間的關(guān)系。
　　 3.沉默PGRN的表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖的影響
　　 ①設(shè)計合成PGRN特異性siRNA，在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和T98G內(nèi)，轉(zhuǎn)染48小時后在mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測PGRN的表達(dá)。
　　 ②采用CCK-8法分析PGRNsiRN

8、A在不同時間點對腫瘤細(xì)胞活性的影響，繪制生長曲線。
　　 ③CCK-8法分析PGRNsiRNA轉(zhuǎn)染后的U87和T98G細(xì)胞對化學(xué)藥物冬凌草甲素敏感性的變化。
　　 4.PGRN影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性的影響及分子機制
　　 ①Transwell法檢測沉默PGRN的表達(dá)對U87和T98G細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 ②RT-PCR和WesternBlot法檢測PGRNsiRNA轉(zhuǎn)染后侵襲性相關(guān)基因MMP-2

9、、MMP-7與MMP-9的變化。
　　 ③明膠酶譜法檢測PGRNsiRNA轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2與MMP-9酶活性的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 ①PGRN在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)
　　 應(yīng)用RT-PCR及WesternBlot方法檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87、U251及T98G中PGRN的表達(dá)，結(jié)果顯示

10、三種細(xì)胞系中均存在明顯的PGRN表達(dá)。
　　 ②PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本中表達(dá)
　　 為進一步研究PGRN在膠質(zhì)瘤中的作用，我們首先采用RT-PCR及WesternBlot的方法檢測35例新鮮星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤手術(shù)標(biāo)本中PGRN的表達(dá)，5例正常對照腦組織標(biāo)本來自腦外傷行內(nèi)減壓的患者。RT-PCR結(jié)果顯示:PGRNmRNA在腫瘤組織的表達(dá)率為97.1％(34/35)，5例正常腦組織未檢測到PGRN的表達(dá)。Western

11、Blot結(jié)果顯示PGRN在腫瘤組織的表達(dá)率為100％，而僅有2例正常腦組織檢測到極微弱的PGRN表達(dá)。為進一步確定PGRN的表達(dá)狀態(tài)，我們采用免疫組化的方法檢測PGRN在210例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本中的表達(dá)。與WesternBlot的結(jié)果相似，正常腦組織顯示陰性染色或僅有零星的神經(jīng)細(xì)胞胞體中存在弱陽性染色，而高達(dá)96.7％(203/210)的腫瘤切片中存在PGRN的陽性染色。PGRN的陽性染色不僅見于腫瘤細(xì)胞，而且也見與腫瘤相關(guān)的血管

12、內(nèi)皮細(xì)胞。這種狀況在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最為明顯，51.1％的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本存在血管的PGRN強陽性表達(dá)。
　　 2.PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中表達(dá)的臨床意義
　　 為闡明PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。我們分析了PGRN的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床特征間的關(guān)系。結(jié)果顯示PGRN的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的年齡、性別、腫瘤位置、KPS評分無明顯相關(guān)性。方差分析顯示無論是腫瘤細(xì)胞的PGRN表達(dá)評分，還是血管內(nèi)皮細(xì)胞

13、的PGRN表達(dá)評分均隨病理級別的升高而增高。通過Kaplan-Meier生存曲線分析和生存率分布Log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，PGRN低表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后明顯好于高表達(dá)的患者(P＜0.001)。進一步的COX多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)PGRN的表達(dá)以及PGRN在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存均是獨立的預(yù)后因素（相對危險系數(shù)，2.506，95％可信區(qū)間，1.511-4.155，P=0.000;相對危險系數(shù)，1.667，95％可信

14、區(qū)間，1.112-2.498，P=0.013)。這說明PGRN的低表達(dá)能改善膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后，延長患者生存時間。
　　 3.沉默PGRN的表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖的影響
　　 為進一步確定PGRN在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用，我們通過siRNA技術(shù)沉默PGRN在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)，觀察它對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　 ①PGRN特異性siRNA可有效抑制PGRN的表達(dá)
　　 設(shè)計合成PGRNsiRNA片段，

15、在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入U87與T98G細(xì)胞內(nèi)。RT-PCR與WesternBlot檢測沉默效果，結(jié)果顯示特異性PGRNsiRNA可有效抑制PGRN的表達(dá)。
　　 ②PGRN沉默表達(dá)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長
　　 對U87與T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性PGRNsiRNA48小時后，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，繪制生長曲線。結(jié)果顯示細(xì)胞生長受到明顯抑制。
　　 ③PGRN沉默表達(dá)增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對冬凌草甲素的敏感性

16、　　 將PGRNsiRNA轉(zhuǎn)入U87及T98G腫瘤細(xì)胞，48小時后加入不同濃度的冬凌草甲素，作用48小時后CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，沉默PGRN的表達(dá)增加腫瘤細(xì)胞對冬凌草甲素的敏感性。
　　 4.PGRN影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性的影響及分子機制
　　 ①PGRN沉默表達(dá)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲能力
　　 應(yīng)用Transwell的方法檢測細(xì)胞的侵襲功能。與對照組相比，PGRNsiRNA轉(zhuǎn)染后U87與T

17、98G細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。
　　 ②PGRN沉默表達(dá)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤MMP-9的表達(dá)
　　 PGRNsiRNA處理U87與T98G細(xì)胞后，RT-PCR檢測侵襲性相關(guān)基因的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MMP-2/-7/-9中只有MMP-9出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平降低。WesternBlot檢測進一步確定了MMP-9在蛋白水平的降低。PGRNsiRNA處理U87與T98G細(xì)胞48小時后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過明膠酶譜法檢測MMP-2/-9的酶活性

18、。結(jié)果顯示MMP-9酶活性下降，進一步從分泌水平確定了PGRN對MMP-9的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本及細(xì)胞系中存在PGRN的表達(dá)。
　　 2.PGRN在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本中的表達(dá)水平與腫瘤的病理級別正相關(guān)。
　　 3.在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，PGRN的高水平表達(dá)預(yù)示著患者的預(yù)后不良。
　　 4.COX多因素回歸分析顯示PGRN的表達(dá)是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存的獨立預(yù)后因素