CDKN2A與EGFR基因在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及對化療敏感性的影響.pdf

1、目的：1.探討CDKN2A在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制;2.探討EGFR基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對化療敏感性的影響;3.了解促進(jìn)CDKN2A過表達(dá)、干擾EGFR表達(dá)在抑制膠質(zhì)瘤生長及增強化療敏感性方面是否具有協(xié)同作用。
　　方法：（一）1.選取中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2007～2011年61例神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者腫瘤組織作為研究標(biāo)本，所有病例未進(jìn)行術(shù)前化療和放療;2.分別用免疫組化及Western blot方法檢

2、測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251-MG、T98G、U87-MG、A172、SW1783、U118-MG、U138-MG、H4和HS-683中CDKN2A的表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析CDKN2A在不同膠質(zhì)瘤病例和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系;3.利用空載體或CDKN2A重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，應(yīng)用免疫組化及Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后CDKN2A的表達(dá)，倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染CDKN2A后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

3、形態(tài)及生長變化，進(jìn)行細(xì)胞集落計數(shù)，繪制生長曲線;4.設(shè)計合成CDKN2A特異的siRNA，應(yīng)用siRNA沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞系HS-683和H4中CDKN2A，Western blot方法檢測細(xì)胞中CDKN2A、Cyclin D和pRb蛋白的表達(dá)，倒置顯微鏡觀察和活細(xì)胞計數(shù)分析siRNA沉默CDKN2A的表達(dá)后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系形態(tài)及生長變化，進(jìn)行細(xì)胞集落計數(shù)，繪制生長曲線;5.在siRNA沉默CDKN2A的表達(dá)后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入Cycli

4、n D1抑制劑-flavopiridol，倒置顯微鏡觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)變化，進(jìn)行細(xì)胞集落計數(shù)，繪制生長曲線，并利用Westernblot方法檢測pRb蛋白的磷酸化水平和cyclin D1表達(dá)變化;（二）1.分別用免疫組化及Western blot方法檢測上述61例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中EGFR的表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析EGFR在不同膠質(zhì)瘤病例中的表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系;2.用EGFR-siRNA沉默U251細(xì)胞EGFR表達(dá)，倒置顯微

5、鏡觀察慢病毒干擾EGFR表達(dá)后U251細(xì)胞形態(tài)及生長變化，進(jìn)行細(xì)胞集落計數(shù)，繪制生長曲線;3.MTT法分別檢測EGFR干擾組-RNAi，BCNU處理組-BCNU，聯(lián)合組-BCNU+RNAi和空白組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長增殖的變化，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;（三）1.利用基因修飾技術(shù)，建立聯(lián)合CDNK2A過表達(dá)和干擾EGFR表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，倒置顯微鏡觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)及生長變化;2.MTT法分別檢測對照干擾組、EGFR干擾組、CDKN2A轉(zhuǎn)染組及

6、CDKN2A轉(zhuǎn)染和EGFR干擾聯(lián)合組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別在相同濃度的BCNU作用下生長增殖的變化，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：（一）1.CDKN2A在不同惡性程度的膠質(zhì)瘤腫瘤組織中表達(dá)量不同，在低分化膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織中CDKN2A表達(dá)量顯著低于高分化膠質(zhì)瘤患者;同樣，在不同惡性級別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平亦顯著低于低級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞;2.CDKN2A過表達(dá)可以有效的抑制集落形成活性和降低細(xì)胞生長率;3.siRN

7、A沉默CDKN2A的表達(dá)后腫瘤細(xì)胞生長速度明顯增高，而flavopiridola可以逆轉(zhuǎn)這種作用，從而延緩HS-683和H4細(xì)胞株的生長;4.siRNA沉默CDKN2A的表達(dá)后腫瘤細(xì)胞降低pRb磷酸化和細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)，同樣flavopiridola可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢;5.與較低級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞系相比，cyclin D1在高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平增高。（二）1.在不同級別膠質(zhì)瘤組織中，EGFR在高級別膠質(zhì)瘤組織中的

8、表達(dá)水平明顯高于低級別腦膠質(zhì)瘤;2.靶向干擾EGFR的表達(dá)可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251增殖活性，增強其對化療藥物BCNU的化療敏感性。（三）EGFR干擾組、CDKN2A轉(zhuǎn)染組均可以有效的抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長率，而CDKN2A轉(zhuǎn)染和EGFR干擾聯(lián)合組亦可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并且顯著優(yōu)于其它各組。
　　結(jié)論：1.CDKN2A的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，而EGFR的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān);2.在惡性膠質(zhì)