CDKN2A與EGFR基因在膠質細胞瘤中的表達及對化療敏感性的影響.pdf

1、目的：1.探討CDKN2A在膠質瘤中的表達及其在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制;2.探討EGFR基因在膠質瘤中的表達及其對化療敏感性的影響;3.了解促進CDKN2A過表達、干擾EGFR表達在抑制膠質瘤生長及增強化療敏感性方面是否具有協(xié)同作用。
　　方法：（一）1.選取中南大學湘雅二醫(yī)院2007～2011年61例神經(jīng)膠質細胞瘤患者腫瘤組織作為研究標本，所有病例未進行術前化療和放療;2.分別用免疫組化及Western blot方法檢

2、測神經(jīng)膠質瘤組織及神經(jīng)膠質瘤細胞系U251-MG、T98G、U87-MG、A172、SW1783、U118-MG、U138-MG、H4和HS-683中CDKN2A的表達，經(jīng)統(tǒng)計學分析CDKN2A在不同膠質瘤病例和膠質瘤細胞系中的表達量與膠質瘤惡性程度之間的關系;3.利用空載體或CDKN2A重組表達載體轉染膠質瘤細胞系，應用免疫組化及Western blot方法檢測轉染后CDKN2A的表達，倒置顯微鏡觀察轉染CDKN2A后神經(jīng)膠質瘤細胞系

3、形態(tài)及生長變化，進行細胞集落計數(shù)，繪制生長曲線;4.設計合成CDKN2A特異的siRNA，應用siRNA沉默膠質瘤細胞系HS-683和H4中CDKN2A，Western blot方法檢測細胞中CDKN2A、Cyclin D和pRb蛋白的表達，倒置顯微鏡觀察和活細胞計數(shù)分析siRNA沉默CDKN2A的表達后神經(jīng)膠質瘤細胞系形態(tài)及生長變化，進行細胞集落計數(shù)，繪制生長曲線;5.在siRNA沉默CDKN2A的表達后神經(jīng)膠質瘤細胞中加入Cycli

4、n D1抑制劑-flavopiridol，倒置顯微鏡觀察膠質瘤細胞形態(tài)變化，進行細胞集落計數(shù)，繪制生長曲線，并利用Westernblot方法檢測pRb蛋白的磷酸化水平和cyclin D1表達變化;（二）1.分別用免疫組化及Western blot方法檢測上述61例神經(jīng)膠質瘤患者腫瘤組織中EGFR的表達，經(jīng)統(tǒng)計學分析EGFR在不同膠質瘤病例中的表達與膠質瘤惡性程度之間的關系;2.用EGFR-siRNA沉默U251細胞EGFR表達，倒置顯微

5、鏡觀察慢病毒干擾EGFR表達后U251細胞形態(tài)及生長變化，進行細胞集落計數(shù)，繪制生長曲線;3.MTT法分別檢測EGFR干擾組-RNAi，BCNU處理組-BCNU，聯(lián)合組-BCNU+RNAi和空白組的膠質瘤細胞生長增殖的變化，并進行統(tǒng)計學分析;（三）1.利用基因修飾技術，建立聯(lián)合CDNK2A過表達和干擾EGFR表達的膠質瘤細胞模型，倒置顯微鏡觀察膠質瘤細胞形態(tài)及生長變化;2.MTT法分別檢測對照干擾組、EGFR干擾組、CDKN2A轉染組及

6、CDKN2A轉染和EGFR干擾聯(lián)合組的膠質瘤細胞分別在相同濃度的BCNU作用下生長增殖的變化，并進行統(tǒng)計分析。
　　結果：（一）1.CDKN2A在不同惡性程度的膠質瘤腫瘤組織中表達量不同，在低分化膠質瘤患者的腫瘤組織中CDKN2A表達量顯著低于高分化膠質瘤患者;同樣，在不同惡性級別的膠質瘤細胞株中，高級別膠質瘤細胞中的表達水平亦顯著低于低級別膠質瘤細胞;2.CDKN2A過表達可以有效的抑制集落形成活性和降低細胞生長率;3.siRN

7、A沉默CDKN2A的表達后腫瘤細胞生長速度明顯增高，而flavopiridola可以逆轉這種作用，從而延緩HS-683和H4細胞株的生長;4.siRNA沉默CDKN2A的表達后腫瘤細胞降低pRb磷酸化和細胞周期蛋白cyclin D1的表達，同樣flavopiridola可以逆轉這種趨勢;5.與較低級別膠質瘤細胞系相比，cyclin D1在高級別膠質瘤細胞系中的表達水平增高。（二）1.在不同級別膠質瘤組織中，EGFR在高級別膠質瘤組織中的

8、表達水平明顯高于低級別腦膠質瘤;2.靶向干擾EGFR的表達可以顯著抑制膠質瘤細胞系U251增殖活性，增強其對化療藥物BCNU的化療敏感性。（三）EGFR干擾組、CDKN2A轉染組均可以有效的抑制U251膠質瘤細胞的生長率，而CDKN2A轉染和EGFR干擾聯(lián)合組亦可以抑制膠質瘤細胞的增殖，并且顯著優(yōu)于其它各組。
　　結論：1.CDKN2A的表達量與膠質瘤的惡性程度呈負相關，而EGFR的表達量與膠質瘤的惡性程度呈正相關;2.在惡性膠質