人類睪丸特異表達新基因MAEL的克隆和表達分析.pdf

1、精子生成是一個多基因參與的復(fù)雜過程，多個與精子發(fā)生相關(guān)的基因已相繼被鑒定。但這些已知的基因如何與其它的基因相互作用來調(diào)控精子的生成過程，以及是否存在其它未知的基因參與精子的發(fā)生目前尚不完全清楚。克隆新的睪丸發(fā)育、生精相關(guān)基因?qū)M一步了解精子發(fā)生機理具有重要意義。
　　 本文利用數(shù)字差異顯示(digital differential display)方法，從篩查人睪丸中高表達而在其他組織中不表達或低表達的差異EST(表達序列標簽)

2、入手，成功克隆到一個在人睪丸中高表達的新基因MAEL(GenBank登錄號為：DQ076156)。RLM—RACE結(jié)果表明，MAEL基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于翻譯起始位點上游第74位核苷酸(nt)，MAEL基因的mRNA全長序列為1751 nt。生物信息學(xué)分析顯示：MAEL基因位于人類1號染色體長臂上(1q24.1)，由12個外顯子組成和11個內(nèi)含子所組成，編碼434個氨基酸，分子量約為49.2kD。
　　 Northern印跡雜交

3、結(jié)果表明，MAEL基因的mRNA只在睪丸組織中高表達，而在卵巢、肺、肝臟、心、腦、脾臟、腎臟等組織中無表達。RNA原位雜交結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)MAEL基因的mRNA在精母細胞、圓形精子和早期伸長型精子中都有表達。EGFP—MAEL融合表達載體的細胞轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)MAEL基因編碼蛋白質(zhì)主要定位于細胞質(zhì)中。
　　 為了進一步了解該基因表達調(diào)控機制，本文分析了MAEL基因的啟動子。首先，將MAEL基因的上游序列(—1510 bp～+150 bp

4、)克隆到載體pTAL—luc的熒光素酶基因上游并構(gòu)建一系列缺失突變，然后將包含全長序列和各種缺失突變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞系HeLa和小鼠精原細胞系GC—1，通過比較熒光素酶的活性發(fā)現(xiàn)，MAEL基因的基本啟動子位于—216 bp與+28bp之間，而+28 bp至+150 bp處有精原細胞系特異表達的增強子序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAEL基因啟動子缺乏TATA盒，而存在3個CACCC盒，1個CCAAT盒和1個倒轉(zhuǎn)的CCAAT盒(ATT