Cyclophilin-D蛋白表達(dá)水平對內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化損傷能力的影響.pdf

1、一、研究背景：每年，全球死于心血管疾病的人數(shù)大約有一千七百萬之多，而冠狀動脈粥樣硬化性心臟病則占所有心血管疾病死亡率的50％以上。血管內(nèi)皮功能與結(jié)構(gòu)的損傷被認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)腱的普遍機(jī)理。因此，尋找一種有效的方法來防治血管內(nèi)皮損傷已成為目前研究的熱點(diǎn)與焦點(diǎn)。 冠狀動脈搭橋術(shù)后橋血管再狹窄的原因仍然是動脈粥樣硬化病變的重復(fù)或延續(xù)。體內(nèi)業(yè)已存在的危險因素從橋血管被連接到冠狀動脈循環(huán)起，就開始了對橋血管內(nèi)皮的作用，造成移植后橋

2、血管內(nèi)皮功能與結(jié)構(gòu)的損傷，粥樣斑塊形成，繼而出現(xiàn)橋血管再狹窄。 血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅是血液和組織之間的屏障，還具有其他多種功能，是一個具有高動力的自分泌和旁分泌器官。內(nèi)皮受損、功能不全可導(dǎo)致冠狀動脈張力調(diào)節(jié)功能受損，NO合成減少、ET分泌增加，內(nèi)皮性生長因子釋放增加，促使脂質(zhì)向內(nèi)膜下遷移、沉著，形成氧化型低密度脂蛋白，平滑肌細(xì)胞由分化狀態(tài)變?yōu)槿シ只癄顟B(tài)，從中層向內(nèi)膜遷移，并在內(nèi)膜下大量增殖和產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)膜重塑，同時激

3、活了血小板、促使血小板釋放活性物質(zhì)如TXA2、5-羥色胺等，從而產(chǎn)生內(nèi)膜斑塊，引起動脈管腔狹窄。 本實(shí)驗(yàn)利用小干擾RNA(smallinterferingRNAsiRNA)沉默CypD蛋白編碼基因Ppif，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中CypD蛋白的表達(dá)水平，同時利用基因克隆技術(shù)，建立CypD蛋白高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞模型，研究在過度氧化應(yīng)激條件下，CypD蛋的不同表達(dá)水平對血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化損傷能力及內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，從而探討CypD蛋白在內(nèi)皮細(xì)

4、胞功能障礙發(fā)生與發(fā)展中的作用，為防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及外科術(shù)后橋血管再狹窄開辟新的思路。 二、研究目的: 1.建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷凋亡模型。 2.觀察凋亡模型中內(nèi)皮細(xì)胞CypD蛋白及其編碼基因Ppif表達(dá)程度的變化與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 3.建立CypD蛋白缺陷型內(nèi)皮細(xì)胞模型，在過度氧化應(yīng)激條件下，比較CypD蛋白缺陷型內(nèi)皮細(xì)胞與正常內(nèi)皮細(xì)胞抗損傷能力的差異及兩組內(nèi)皮細(xì)胞功能的變化。 4.

5、建立CypD蛋白高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞模型，在過度氧化應(yīng)激條件下，比較CypD蛋白高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞與正常內(nèi)皮細(xì)胞抗損傷能力的差異。 三、實(shí)驗(yàn)對象和方法: 1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞： 在37℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用10％FCS的高糖型DMEM培養(yǎng)從武漢大學(xué)典藏中心購買的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞。 2.建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷凋亡模型： 將細(xì)胞分為A、B、C、D四組，每組重復(fù)3次。其中A、B、C為實(shí)驗(yàn)組

6、，分別用含100uM、300uM和500uMH2O2處理ECV304細(xì)胞，于飽和濕度、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0min、30min、60min、90min和120min，換普通含10％FCS的高糖型DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，D組為空白對照組，用不含H2O2的PBS液處理細(xì)胞，方法同上。 3.建立CypD缺陷型細(xì)胞： Ppif基因的siRNA由上海吉瑪生物公司合成，其雙鏈的基因序列為：Sence5'—GCCG

7、CUUUCCUGACGAGAATT—3’，Anti—sence5’—UUCUCGUCAGGAAAGCGGCTT—3’。將ECV304細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞生長致融合70％時，用Lipofectamine2000按其說明上推薦的步驟，將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)ECV304細(xì)胞，6h后用熒光顯微鏡和流式儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染率的檢測，并更換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、48h、72h。 4、建立CypD高表達(dá)型細(xì)胞

8、： 合成Ppif基因的cDNA，并與載體pCDNA6/myc—HisB相連，生成Ppif質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，建立CypD蛋白高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞模型。 5.實(shí)驗(yàn)分組： 按CypD蛋白是否正常分為CypD缺陷型細(xì)胞組、CypD蛋白高表達(dá)細(xì)胞組和正常細(xì)胞組，每組3個以上樣本。三組細(xì)胞均用凋亡模型濃度的H2O2處理120min或90min后，更換普通培養(yǎng)基再培養(yǎng)12h或24h，然

9、后進(jìn)行后續(xù)檢測。 6.流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。 7.Westernblot檢測： 提取各組細(xì)胞樣本的總蛋白，westernblot檢測樣本中CypD蛋白的相對表達(dá)水平。 8.實(shí)時熒光定量RT—PCR檢測(q—RT—PCR)： 提取各組細(xì)胞樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA進(jìn)行real—timePCR，分析各組細(xì)胞的Ppif基因的相對表達(dá)水平。 9.NO檢測： 按照NO檢測試劑

10、盒說明書操作，在540nm檢測吸光度OD值，根據(jù)公式計(jì)算NO含量。 10.電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 計(jì)量資料以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析、雙變量相關(guān)分析以及均數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型組中的凋亡率、NO及CypD蛋白、Ppif基因相對表達(dá)量的變化： 重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析示A、B、D三

11、組間細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但C組與A、B、D組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，均數(shù)檢驗(yàn)示C組內(nèi)各時間點(diǎn)的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析示C組凋亡率與H2O2作用時間呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.982，P<0.001)。 C組與D組細(xì)胞培養(yǎng)液中總一氧化氮的量分別為(8.46±0.77)μM和(21.28±1.94)μM，兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的結(jié)果表明差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D

12、組的一氧化氮分泌總量明顯比C組的要高，P<0.001。 正常ECV304細(xì)胞中CypD蛋白的分子量約為17KD。在C組中，隨著氧化應(yīng)激時間延長，CypD蛋白和ppif基因表達(dá)量也逐漸增加。30min、60min、90min和120min時間點(diǎn)的ppif基因表達(dá)量分別為0min的2.19倍、2.48倍、2.36倍和1.64倍(P<0.05)。 2.CypD缺陷型細(xì)胞凋亡率、NO及CypD蛋白、Ppif基因相對表達(dá)量的變化：

13、 流式檢測siRNA的瞬時轉(zhuǎn)染率為(97.96±0.31)％。 Q—RT—PCR結(jié)果表明，Ppif的沉默效率在轉(zhuǎn)染后的第48h最高，下調(diào)達(dá)11倍。 siRNA轉(zhuǎn)染后westernblot檢測結(jié)果顯示，CypD蛋白表達(dá)水平隨轉(zhuǎn)染時間延長而逐漸減弱。 CypD缺陷型細(xì)胞組與正常細(xì)胞組的凋亡率分別為(32.51±6.6)％和(52.57±5.84)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。 CypD缺陷型

14、細(xì)胞組與正常細(xì)胞組細(xì)胞培養(yǎng)液中總一氧化氮的量分別為(24.06±3)μM和(13.03±3.55)μM，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.015。 3.CypD高表達(dá)細(xì)胞凋亡率及CypD蛋白、Ppif基因相對表達(dá)量的變化： Q—RT—PCR結(jié)果表明，Ppif的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的第24h最高，上調(diào)達(dá)274倍。 Ppif質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后westernblot檢測結(jié)果顯示，CypD蛋白表達(dá)水平隨轉(zhuǎn)染時間延長而逐漸升高，在轉(zhuǎn)染后

15、第48h達(dá)最高峰。 CypD高表達(dá)型細(xì)胞組與正常細(xì)胞組的凋亡率分別為(24.24±3.08)％和(7.7±0.68)％，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 4.細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化： 透射電鏡觀察，PBS對照組以正常細(xì)胞為主，很少見凋亡；凋亡模型組細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡樣改變，凋亡細(xì)胞很多，細(xì)胞微絨毛減少，大多數(shù)細(xì)胞核碎裂，可見典型核染色質(zhì)濃集，分布于核膜周邊，線粒體高度腫脹，細(xì)胞器高度破壞并出現(xiàn)較多空泡，部分僅

16、見細(xì)胞輪廓；而CypD缺陷型細(xì)胞組中，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯較凋亡模型組減少，形態(tài)改變也較輕，多為早期凋亡特征，線粒體腫脹成球型，許多細(xì)胞膜仍正常。 五、結(jié)論: 1.證實(shí)了在氧化應(yīng)激條件下，CypD蛋白是ROS誘導(dǎo)增多的，引起線粒體損害、進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵的損傷性蛋白。 2.改進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡模型。模型中，即使去除了氧化應(yīng)激的因素，細(xì)胞凋亡反應(yīng)仍在繼續(xù)，使模型的生理模擬性和特異性更高。 3.