S-生物丙烯菊酯對人淋巴細胞的毒性作用及基因表達譜變化的初步研究.pdf

1、隨著社會和科技的發(fā)展，環(huán)境安全問題逐漸被提上議事日程。農(nóng)藥使用的日漸廣泛，使得作為蚊香、蚊片、殺蟲劑等主要有效成分的S-生物丙烯菊酯(S-bioallethrin)和人們的生產(chǎn)生活接觸日益密切，其遠后效應也逐漸顯露出來。人們發(fā)現(xiàn)，長期接觸S-生物丙烯菊酯會導致神經(jīng)系統(tǒng)和過敏樣的綜合征，并伴有肌肉和關節(jié)的疼痛綜合征，如記憶力減退、嗅覺減退、脫發(fā)、甲狀腺功能減退、白癜風、過敏反應等；許多研究都表明S-生物丙烯菊酯具有一定的免疫毒性和神經(jīng)毒性

2、。 S-生物丙烯菊酯對免疫系統(tǒng)具有的毒性作用表現(xiàn)為：可以抑制T淋巴細胞增殖，導致嗜堿粒細胞釋放組胺；可有效的抑制IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生；還可抑制細胞內Th2特異性的信號轉導催化因子6(STAT6)，從而抑制淋巴細胞信號轉導；過敏體質的人比正常人更易對S-生物丙烯菊酯產(chǎn)生中毒癥狀。S-生物丙烯菊酯對神經(jīng)系統(tǒng)具有的毒性作用表現(xiàn)為：可導致幼年小鼠腦皮質乙酰膽堿受體減少，并導致腦皮質永久性病理改變和成年后行為異常；可抑制白細胞膜和神

3、經(jīng)突觸體的ATP酶活性，從而確定了S-生物丙烯菊酯對哺乳動物的神經(jīng)毒性是因為導致神經(jīng)細胞膜功能的整體失調。但S-生物丙烯菊酯對機體毒性作用的具體機制尚未闡明。 S-生物丙烯菊酯的毒性作用必然會對機體的基因表達造成一定影響，但如何影響仍尚未闡明，因此，本課題擬研究S-生物丙烯菊酯處理后正常人淋巴細胞的基因表達變化。尋找差異基因的方法有很多種，如差異顯示技術、代表性差異分析、抑制性消減雜交、基因芯片等。其中基因芯片是近年來發(fā)展起來的

4、一門新的基因分析技術，尤其是表達譜基因芯片，可對基因表達情況進行全面、快速、敏感、高效的分析，因此本課題選用表達譜基因芯片作為研究工具。 本課題首先從形態(tài)學方面觀察了S-生物丙烯菊酯處理后正常人淋巴細胞的變化，然后進一步分析了淋巴細胞基因表達的改變，從而初步闡明了S-生物丙烯菊酯對機體免疫系統(tǒng)和基因組的毒性作用。 論文分兩部分： 第一部分：采用光鏡、流式細胞儀、透射電鏡、DNA片斷化檢測等方法，觀測了S-生物丙烯

5、菊酯處理后正常人淋巴細胞的各種變化。首先從正常人外周血中分離淋巴細胞，對照組為正常淋巴細胞；植物血球凝集素(PHA)組在正常淋巴細胞中加入PHA，終濃度為20mg/L；S-生物丙烯菊酯組在正常淋巴細胞中加入PHA和S-生物丙烯菊酯，終濃度分別為20mg/L和4.5mg/L，進行光鏡檢測。對三組細胞分別進行固定、漂洗、碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測。然后對正常和S-生物丙烯菊酯組細胞進行固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片、染色、透射

6、電鏡觀察。最后提取兩組細胞的基因組DNA，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結果：在光鏡下觀察S-生物丙烯菊酯處理后的正常人淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)細胞增殖被部分抑制，有的細胞體積變小、變形，細胞核濃縮，但細胞膜完整。采用單向方差分析(OneWayANOVA)結果表明S-生物丙烯菊酯可以抑制細胞增殖(P＜0.001)。流式細胞儀檢測結果顯示S-生物丙烯菊酯處理組淋巴細胞S期和G2期均比PHA處理組降低，但仍高于正常淋巴細胞組，表明淋巴細胞增殖

7、被部分抑制；且G1期峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，表明可能有凋亡細胞群體，百分率為32％。透射電鏡結果顯示S-生物丙烯菊酯處理組淋巴細胞核染色質高度凝集、邊緣化，細胞呈現(xiàn)出凋亡特征。DNA片斷化檢測結果顯示S-生物丙烯菊酯處理組細胞DNA電泳條帶呈典型的梯狀條帶，可見每隔200bp位置出現(xiàn)DNA降解條帶，表明細胞出現(xiàn)凋亡。 結論：S-生物丙烯菊酯可以有效地抑制正常淋巴細胞增殖，使細胞增殖進程受阻，并可導致部分淋巴細胞凋亡，對機體免疫系統(tǒng)具

8、有一定的毒性。 第二部分：運用基因芯片技術，檢測了S-生物丙烯菊酯處理后淋巴細胞的基因表達譜變化。首先提取正常和S-生物丙烯菊酯組淋巴細胞的總RNA，采用AgilentBioAnalyzer2100進行RNA樣品的質量鑒定。采用Agilent低RNA熒光線性擴增試劑盒對樣品進行雙色熒光標記：總RNA逆轉錄合成cDNA，以Cy3標記正常淋巴細胞，Cy5標記S-生物丙烯菊酯處理組淋巴細胞，合成熒光標記的cRNA，并對標記的cRNA進

9、行純化。純化后的樣品和AgilentHuman1A60mer寡核苷酸基因芯片進行雜交，雜交完畢后依次用漂洗緩沖液進行芯片的漂洗。然后采用Agilent基因芯片掃描儀掃描，掃描后的數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction軟件進行數(shù)據(jù)采集及標準化處理。然后采用Panther數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行生物學功能分析。最后采用半定量RT-PCR對有進一步研究價值且表達改變顯著的基因FXR2、TNFRSF10A、AIRE和IL-19進行驗證。

10、 結果：在芯片22153個檢測點中，發(fā)現(xiàn)共同差異表達基因346個，其中23個基因表達上調，主要涉及凋亡(CEBPB、TNFRSF10A、BLK、CARD9、FXR2、DLGAP1、ATF1)，發(fā)育過程(PAFAH1B3、GLI2、FLJ90440)，核苷酸代謝(SFRS12)等方面；323個基因表達下調，主要涉及免疫與防御[MR-1、IRF2、A1(SAA1)、AIF1、CXCL1、IL-19、KREMEN2、HSPCA、ANXA8

11、、HSF2、AIRE]，轉錄調節(jié)(OTX2、RARG、ERG、PTTG1、ZNF135、KLF12)，信號轉導(SDK2、CNGB1、PIK3R2、PTCH、ELK3、KIAA1854)，細胞增殖和分化(ESM1、REA、ING3)等方面。RT-PCR結果表明，S-生物丙烯菊酯處理后，AIRE和IL-19的表達下調，F(xiàn)XR2和TNFRSF10A的表達上調，與芯片雜交結果基本一致。 結論：S-生物丙烯菊酯處理后淋巴細胞基因表達譜的

12、變化為：促凋亡基因表達上調的同時凋亡抑制基因表達下調，促增殖基因表達下調，并有多個促進細胞增殖信號傳導、促進免疫應答的基因表達下調?；虮磉_的總體變化趨勢是促進凋亡、抑制增殖，表明S-生物丙烯菊酯對基因組具有一定的毒性。 綜上所述，本研究采用S-生物丙烯菊酯處理正常人淋巴細胞，利用光鏡、流式細胞儀、透射電鏡、DNA片斷化檢測等手段，觀測了淋巴細胞的變化。研究表明，S-生物丙烯菊酯可以抑制淋巴細胞增殖，并誘導部分淋巴細胞凋亡，具有