米諾環(huán)素對脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞NF-κB p65活性的影響.pdf

1、目的：通過觀察米諾環(huán)素和NF—κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸乙酯（PDTC）對細菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）核轉(zhuǎn)錄因子—κB（NF—κB）活性的影響，探討米諾環(huán)素可能的抗炎機制。 方法： 1．復(fù)蘇、培養(yǎng)并鑒定細胞。 2．用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法，檢測不同濃度的米諾環(huán)素或PDTC對體外培養(yǎng)的HUVECs細胞活性的影響。 3．用不同濃度的米諾環(huán)素（1μmol/L、10μmo

2、l/L、100μmol/L）或抗氧化劑PDTC（100μmol/L）與HUVECs共同培養(yǎng)1h，再加LPS（1μg/ml）誘導(dǎo)HUVECs NF—κB的活化，應(yīng)用流式細胞檢測術(shù)（flow cytometry FCM）檢測NF—κB p65的表達，用激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）檢測NF—κB p65在HUVECs中表達的核/漿（FN/FC）熒光強度比。 結(jié)果： 1．HUVECs經(jīng)vWF染色鑒定為內(nèi)皮細胞。 2．

3、MTT檢測結(jié)果：3種不同濃度的米諾環(huán)素組，OD570分別為0．681±0．013、0．677±0．023、0．665±0．007；PDIC組OD570=0．664±0．009；LPS組OD570=0．667±0．010；3種不同濃度的米諾環(huán)素或PDTC預(yù)處理后與LPS共同孵育細胞，OD570分別為0．672±0．019、0．661±0．009、0．668±0．016、0．663±0．017，以上各組與對照組（OD570=0．670±0．

4、011）比較，其細胞活性均無明顯差異（P>0．05）。 3．流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：HUVECs NF—κBp65的基礎(chǔ)表達率為9．6±0．5％，不同濃度米諾環(huán)素或PDTC單獨孵育細胞2h后，對HUVECs NF—κBp65的基礎(chǔ)表達無影響（P>05）；在LPS誘導(dǎo)0．5h后NF—κB即有明顯表達（17．282±1．636），作用1～2h達高峰（35．022±1．949），之后下降，不同濃度米諾環(huán)素或PDTC與LPS共同孵育細胞

5、2h后，則明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF—κB p65的表達（P<0．05），且抑制強度與米諾環(huán)素濃度呈正相關(guān)（r=0．945），100μmol/L的米諾環(huán)素預(yù)處理組（18．160±1．363）與PDTC預(yù)處理組（16．960±0．892）對LPS誘導(dǎo)的NF—κB p65的表達抑制率無明顯差異（P>0．05）。 4．LPS刺激HUVECs2h后的CLSM結(jié)果顯示：紅色核區(qū)內(nèi)出現(xiàn)代表NF—κB P65的綠色熒光（FN/FC=1．334±

6、0．190），不同濃度米諾環(huán)素預(yù)處理組或PDTC預(yù)處理組的FN/FC下降，其抑制效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．05），且抑制強度與米諾環(huán)素濃度呈正相關(guān)（r=0．892），100μmol/L的米諾環(huán)素預(yù)處理組（FN/FC=0．731±0．079）與PDTC預(yù)處理組（FN/FC=0．723±0．572）的FN/FC無明顯差異（P>0．05），未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的HUVECs核區(qū)內(nèi)未出現(xiàn)綠色熒光，其FN/FC=0．406±0．141，明顯低于經(jīng)LPS