人胚胎干細(xì)胞來源的組織工程上皮重建眼表面的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 人胚胎干細(xì)胞向表皮外胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化條件的優(yōu)化
　　目的：從誘導(dǎo)方式、時(shí)間、載體以及培養(yǎng)環(huán)境中的氧含量等方面優(yōu)化胚胎干細(xì)胞H1向表皮外胚層方向分化條件，實(shí)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞來源的上皮樣細(xì)胞的體外快速擴(kuò)增。
　　方法：應(yīng)用視黃酸(Retinoic acid,RA)和骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein4，BMP4)作為誘導(dǎo)劑，通過不同方式（直接誘導(dǎo)和

2、擬胚體誘導(dǎo)）、誘導(dǎo)時(shí)間(2天，4天，6天，8天)、載體（Matrigel和CollagenⅣ）以及調(diào)節(jié)誘導(dǎo)環(huán)境中氧濃度含量（常氧20％ O2和低氧2％ O2）處理H1細(xì)胞，使其向表皮外胚層方向分化，觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)變化。為了選取最佳誘導(dǎo)條件，收集各實(shí)驗(yàn)組及未誘導(dǎo)H1細(xì)胞的RNA，檢測胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4，表皮外胚層標(biāo)志物p63和K18，神經(jīng)外胚層標(biāo)志物Nestin，中胚層標(biāo)志物Brachyury(Bra)，內(nèi)胚層標(biāo)志物AFP，

3、Notch和Wnt信號通路相關(guān)因子表達(dá)的變化情況。為了檢測誘導(dǎo)后的上皮樣細(xì)胞的活性，消化所得上皮樣細(xì)胞與3T3細(xì)胞共培養(yǎng)做上皮細(xì)胞克隆培養(yǎng)。為了選取H1來源的上皮樣細(xì)胞的最佳擴(kuò)增條件，誘導(dǎo)后得到的上皮樣細(xì)胞同一密度接種于CollagenⅣ處理的培養(yǎng)皿中，利用添加或不添加Y27632的擴(kuò)增培養(yǎng)基KSFM，KSFM+Supplement，KSFM+SHEM(2∶1)，KSFM+SHEM(3∶1)進(jìn)行培養(yǎng)，并用倒置相差顯微鏡觀察各擴(kuò)增條件下細(xì)

4、胞形態(tài)，比較各組細(xì)胞增殖能力及上皮表型的維持情況。
　　結(jié)果：聯(lián)合應(yīng)用RA和BMP4誘導(dǎo)H1細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4逐漸下降，表皮外胚層標(biāo)志物K18和p63表達(dá)逐漸增加，中胚層標(biāo)志物Bra及內(nèi)胚層標(biāo)志物AFP表達(dá)水平較低，誘導(dǎo)8天為最佳時(shí)間點(diǎn)。貼壁誘導(dǎo)方式與擬胚體誘導(dǎo)方式相比可得到p63表達(dá)更高的上皮樣細(xì)胞。誘導(dǎo)后的細(xì)胞可形成克隆且表達(dá)PanCK和p63。利用Matrigel作為誘導(dǎo)載體更易于表皮外胚層的

5、分化。常氧條件下可抑制誘導(dǎo)過程中AFP和Bra的表達(dá)，且促進(jìn)p63的表達(dá)。KSKFM+SHEM(2∶1)中培養(yǎng)的上皮樣細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞連接清晰可見。低氧培養(yǎng)條件和Y27632可提高H1來源的上皮樣細(xì)胞存活量及增殖能力。Notch1和Jagged1在H1向上皮方向分化過程中表達(dá)量降低，但在上皮樣細(xì)胞擴(kuò)增過程中，加入Y27632后，伴隨著細(xì)胞增殖能力的增加，Notch1和Jagged1的表達(dá)量增加，而c-myc和Cyclin D1表達(dá)量

6、在誘導(dǎo)和擴(kuò)增過程中都降低。
　　結(jié)論：(1)H1細(xì)胞接種于Matrigel膠上，利用貼壁誘導(dǎo)方式，常氧(20％)培養(yǎng)環(huán)境下聯(lián)合應(yīng)用視黃酸和骨形成蛋白BMP4誘導(dǎo)H1細(xì)胞8天，更易于促進(jìn)H1細(xì)胞向表皮外胚層方向誘導(dǎo)，同時(shí)抑制其向內(nèi)胚層和中胚層方向分化，得到具有干細(xì)胞特性的上皮樣細(xì)胞。(2)KSFM+SHEM(2∶1)和KSFM+Supplement均可作為備選擴(kuò)增培養(yǎng)基。(3)擴(kuò)增過程中，低氧培養(yǎng)環(huán)境和Y27632的加入可增加H1來

7、源的上皮樣細(xì)胞的存活率和增殖能力。(4)在H1誘導(dǎo)向上皮方向誘導(dǎo)分化過程中，Wnt和Notch信號通路被抑制，而在擴(kuò)增過程中，Y27632的加入可激活Notch信號通路，同時(shí)抑制Wnt信號通路從而促進(jìn)上皮樣細(xì)胞增殖。
　　第二部分 胚胎干細(xì)胞系H1來源的上皮樣細(xì)胞片的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建胚胎干細(xì)胞H1來源的上皮樣細(xì)胞片。
　　方法：制備凍干去上皮羊膜，將H1來源的上皮樣細(xì)胞接種于羊膜上，前4天浸沒培養(yǎng)，然后進(jìn)行氣液界面

8、培養(yǎng)14天。按培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度不同，可分為三個(gè)組即低氧(2％)組，常氧(20％)組，低氧-常氧相結(jié)合組（前4天2％氧濃度，后14天20％氧濃度下培養(yǎng)，每組分別利用添加10μMY27632的KSFM+Supplement和KSFM+SHEM(2∶1)兩種擴(kuò)增培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。終止培養(yǎng)后，一部分用虹膜恢復(fù)器刮取上皮片，刮下的細(xì)胞片收集蛋白;一部分連同羊膜固定包埋，用HE、免疫熒光、免疫組織化學(xué)和Western blot方法對其表型進(jìn)行檢測。<

9、br>　　結(jié)果：低氧、常氧和低氧-常氧相結(jié)合組的細(xì)胞均可在凍干去上皮羊膜上存活，培養(yǎng)18天后，低氧和常氧組中細(xì)胞只可形成零碎的小片細(xì)胞片，且易破碎。低氧-常氧相結(jié)合組可輕易刮下完整透明上皮片，且不易破碎。包埋做HE染色可見低氧組中細(xì)胞僅為單層，完全常氧和低氧-常氧相結(jié)合組中的上皮片全部為3-4層細(xì)胞，其中低氧-常氧相結(jié)合組的細(xì)胞排列較為緊密。免疫熒光、免疫組織化學(xué)、Western blot結(jié)果顯示，各組中細(xì)胞均表達(dá)PanCK、K18和p

10、63，低氧-常氧相結(jié)合組部分細(xì)胞表達(dá)K14，但未見有Vimentin和Pax6表達(dá)。兩種培養(yǎng)基表達(dá)上述標(biāo)志物情況類似，但K10僅表達(dá)在KSFM+Supplement+Y27632培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中。
　　結(jié)論：采用低氧-常氧相結(jié)合的方式接種于羊膜上可得到完整，透明的上皮片，并可輕易從羊膜上刮下，通過表型檢測發(fā)現(xiàn)此構(gòu)建的上皮片含有部分干細(xì)胞。
　　第三部分 胚胎干細(xì)胞系H1來源的上皮樣細(xì)胞片體內(nèi)功能檢測
　　目的：采用動

11、物模型對胚胎干細(xì)胞來源的上皮片進(jìn)行眼表面重建的體內(nèi)功能檢測。
　　方法：將KSFM+Supplement+Y2732和KSFM+SHEM(2∶1)+Y27632培養(yǎng)的H1來源的上皮樣細(xì)胞片做細(xì)胞追蹤標(biāo)記后，移植入健康裸鼠皮下，上皮面緊貼皮膚上皮基底層，2周后觀察其移植部位是否成瘤。將健康新西蘭大白兔角膜緣及角膜上皮予以完全性機(jī)械刮除，制造角膜上皮干細(xì)胞缺乏模型。隨機(jī)分組。移植去上皮羊膜作為對照組A。分別移植KSFM+SHEM(2∶

12、1)+Y27632(實(shí)驗(yàn)組B)和KSFM+Supplement+Y2732（實(shí)驗(yàn)組C）培養(yǎng)的H1來源的上皮樣細(xì)胞片連帶羊膜到眼表面，用生物膠粘合。術(shù)后常規(guī)用藥，術(shù)后每天于裂隙燈顯微鏡下做眼表常規(guī)檢查，2周后處死實(shí)驗(yàn)兔，用免疫熒光及免疫組化技術(shù)進(jìn)行PanCK，K14，K3/K12及Pax6表達(dá)的檢測。
　　結(jié)果：將構(gòu)建的H1來源的上皮樣細(xì)胞片移植入健康裸鼠體內(nèi)2周后未見腫瘤形成。在角膜緣干細(xì)胞缺乏兔模型上移植其上培養(yǎng)或未培養(yǎng)細(xì)胞的凍

13、干去上皮羊膜，2周后觀察發(fā)現(xiàn)對照組A組兔角膜基質(zhì)水腫、渾濁，周邊角膜新生血管長入，中央角膜上皮生長不良，HE染色有炎癥細(xì)胞浸潤。實(shí)驗(yàn)組B組兔和C組兔角膜上皮均已愈合。未見明顯新生血管長入，HE染色未見明顯炎癥細(xì)胞。免疫熒光染色顯示PanCK，K3/K12在各組兔角膜表達(dá)情況與在未手術(shù)正常兔角膜上皮類似。K14僅表達(dá)于正常兔角膜上皮基底細(xì)胞層，但在術(shù)后三組兔中的周邊角膜及中央角膜均出現(xiàn)表達(dá)。在B組兔中可見移植的H1來源的上皮樣細(xì)胞，并出現(xiàn)