胚胎干細(xì)胞來源平滑肌細(xì)胞的純化及功能研究.pdf

1、背景：平滑肌細(xì)胞（SMC）是構(gòu)成血管主要的細(xì)胞成分之一。無論在生理情況下，還是在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、癌癥等病理情況下，SMC都發(fā)揮重要的作用。與骨骼肌或心肌細(xì)胞這些“終末分化”細(xì)胞不同的是，SMC在不同的分化階段、甚至在成體器官中仍然具有明顯的可塑性，并能夠發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。SMC從靜止、收縮的分化表型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋澈头置诠δ芑钴S的去分化表型被認(rèn)為是許多SMC相關(guān)疾病重要的發(fā)病機(jī)制之一。全面理解SMC正常發(fā)育、成熟和分化的調(diào)控機(jī)制不僅對(duì)于認(rèn)識(shí)

2、血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、闡明其發(fā)病機(jī)制并為這些疾病的治療提供新的靶點(diǎn)至關(guān)重要，而且還有助于加深對(duì)先天血管發(fā)育缺陷性疾病的理解。此外，闡明SMC正常發(fā)育機(jī)制還可能為SMC相關(guān)性疾病的細(xì)胞治療、血管組織工程和血管組織構(gòu)建的治療學(xué)奠定基礎(chǔ)。但是要達(dá)到上述目的，首先亟須獲得能夠再現(xiàn)平滑肌正常發(fā)育及成熟過程的SMC。 胚胎干細(xì)胞（ESC）是從胚胎早期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的全能干細(xì)胞，具有分化為三個(gè)胚層來源細(xì)胞的能力。在體外懸浮培養(yǎng)時(shí)，ES

3、C能夠自發(fā)分化形成囊狀結(jié)構(gòu)的胚胎小體（EB），EB中包含了三個(gè)胚層來源的細(xì)胞。有研究表明EB可形成可見的自發(fā)收縮的SMC，這表明ESC來源的SMC可以再現(xiàn)SMC的分化和成熟過程。就這點(diǎn)而言，ESC-EB系統(tǒng)似乎是較為理想的研究SMC分化的模型。但值得注意的是，這一模型也有其不足之處。ESC的多能性雖然為多種功能細(xì)胞提供了利于其分化的環(huán)境因素，但當(dāng)對(duì)某種特定細(xì)胞類型（如SMC）進(jìn)行研究時(shí)，其他非興趣細(xì)胞的“污染”反而阻礙了研究的進(jìn)行。解決

4、這一難題的關(guān)鍵在于將所要研究的細(xì)胞類型（本研究中為SMC）從ESC分化形成的多種細(xì)胞類型中分離純化出來。 目的：利用平滑肌特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的嘌呤霉素抗性（pac）基因及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因雙表達(dá)載體，通過抗性篩選純化ESC來源的SMC，并進(jìn)一步研究其功能。 方法： 1.平滑肌特異性SM22a啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的pac基因及EGFP雙表達(dá)載體構(gòu)建:1）SM22α啟動(dòng)子克?。簭男∈蠡蚪M中用PCR法擴(kuò)擴(kuò)增541

5、 bp的SM22α啟動(dòng)子，引物兩端加AseⅠ/NheⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。上游引物：AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG；下游引物：GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG。將SM22α啟動(dòng)子序列克隆到pMD19-T Simple載體擴(kuò)增，然后用AseⅠ/NheⅠ雙酶切獲得SM22α啟動(dòng)子片段。AseⅠ/NheⅠ雙酶切去掉pIRES2-EGFP中的CMV啟動(dòng)子。將SM22α啟動(dòng)子插入得到中間載體

6、pSM22α-IRES2-EGFP。2）Pac基因獲?。篐indⅢ/ClaⅠ雙酶切載體pSM2C得到663bp的pac基因，將其亞克隆到pSUPER.basic中得到pSUPER-PAC。3）BgⅢ/AccⅠ雙酶切pSUPER-PAC獲得pac基因并將其插入到pSM22-IRES2-EGFP中，構(gòu)建pSM22α-PAC-IRES2-EGFP，經(jīng)酶切鑒定成功的載體送測(cè)序。將測(cè)序成功的載體轉(zhuǎn)染小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）系SVEC及SMC，驗(yàn)

7、證該載體是否有效。 2.ESC培養(yǎng)及pSM22α-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)基因ESC制備:獲取孕12.5-14.5d小鼠胚胎制備原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），使用前用絲裂霉素C處理2h，作為ESC的飼養(yǎng)層細(xì)胞。小鼠ESC細(xì)胞株R1常規(guī)培養(yǎng)于飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF上。每天換液，隔天進(jìn)行傳代。轉(zhuǎn)染前，將ESC傳代到0.1%明膠包被的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)皿中。將線性化的pSM22α-PAC-IRES2-EGFP質(zhì)粒DNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ESC。5h后

8、換ESC培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，然后用含有500μg/ml G418的ESC培養(yǎng)液篩選。共篩選約2周，傳代1次。挑取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。制作EB觀察有無EGFP表達(dá)，對(duì)于有EGFP表達(dá)的克隆進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增pac基因轉(zhuǎn)錄子鑒定ESC轉(zhuǎn)染是否成功。鑒定轉(zhuǎn)染成功的ESC克隆被命名為SPIE-ESC。 3.EB培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及SMC純化:將SPIE-ESC消化成單細(xì)胞懸液，接種到細(xì)菌培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)5d，形成EB。第6d將EB接種

9、到明膠包被的組織培養(yǎng)皿中使其貼壁分化，分化培養(yǎng)基中添加10-8mol/L全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)分化5d，每天換液。第11 d時(shí)用10μg/ml嘌呤霉素篩選誘導(dǎo)分化細(xì)胞3d。篩選后存活的細(xì)胞重新接種到新的培養(yǎng)皿中。篩選到的細(xì)胞被命名為SM22α-SMC。流式細(xì)胞儀分析篩選所得細(xì)胞的純度。 4.流式細(xì)胞儀測(cè)定SM22α-SMC純度:將未篩選的SPIE-ESC和SM22α-SMC消化成單細(xì)胞并用70μm尼龍網(wǎng)過濾。用流式細(xì)胞儀獲

10、取10000個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用CellQuest軟件分析。以正常ESC作為陰性對(duì)照。 5.免疫細(xì)胞化學(xué):將SM22α-SMC接種到0.1%明膠包被的蓋玻片上。4%多聚甲醛固定，0.2%TritonX-100通透，5% BSA封閉。一抗為小鼠抗SMα-actin，兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）及兔抗SM22α。二抗為相應(yīng)的四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記的IgG。DAPI染核后封片并在熒光顯微鏡下觀察染色情況。

11、6.Western blot分析:搜集大鼠原代主動(dòng)脈SMC、未經(jīng)篩選的SPIE-ESC分化細(xì)胞及SM22α-SMC并裂解。離心后取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度。等量上樣后經(jīng)10% SDS-PAGE膠電泳分離。濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗為小鼠抗SMα-actin，兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）及兔抗SM22α。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)IgG。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。 7.SMC收縮功

12、能測(cè)定:將純化的SM22α-SMC在0.1%明膠包被的蓋玻片上培養(yǎng)24h。更換新鮮培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)液中加入卡巴可，使其終濃度為含10μmol/L。從加入卡巴可時(shí)開始采集圖像，每隔30 s采集一張，總觀察時(shí)間30 min。計(jì)算收縮面積百分比并與陰性對(duì)照SVEC比較。 8.利用Matrigel測(cè)定SMC募集功能:用Matrigel包被蓋玻片并將其置于24孔板中，將等量小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞SVEC及SM22α-SMC（各1×104個(gè)）混

13、合培養(yǎng)于Matrigel上。12 h或60 h熒光顯微鏡下觀察SMC的募集情況。1×104個(gè)SVEC單獨(dú)培養(yǎng)用于觀察管腔樣結(jié)構(gòu)形成。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次。用SPSS11.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用Student's t檢驗(yàn)。p<0.05被認(rèn)為差異有顯著性。 結(jié)果： 1. pSM22α-PAC-IRES2-EGFP載體構(gòu)建:測(cè)序結(jié)果證實(shí)載體構(gòu)建成功。該載體

14、在SMC中能驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)，而在SVEC中不能驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)，表明該載體有效且特異。 2. SPIE-ESC建立及ESC來源SM22α-SMC的純化:G418篩選2周后，挑取并擴(kuò)增仍然存活的ESC克隆。RT-PCR法檢測(cè)pac基因轉(zhuǎn)錄鑒定轉(zhuǎn)染是否成功。共有4株克隆被證明成功轉(zhuǎn)染pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。ATRA誘導(dǎo)分化后熒光顯微鏡下可見EGFP表達(dá)的SM22α-SMC。SM22α-SMC位于貼壁分化EB的周

15、邊部位。在沒有進(jìn)行嘌呤霉素篩選之前，可以看見典型的呈未分化形態(tài)的細(xì)胞集落。而經(jīng)過嘌呤霉素篩選3d后，僅剩下EGFP陽性的SM22α-SMC。這些細(xì)胞呈梭形，與大鼠主動(dòng)脈SMC相似。 3.篩選后的SM22α-SMC純度達(dá)到99%:未經(jīng)篩選的ATRA誘導(dǎo)分化10 d的SPIE-ESC經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定，EGFP表達(dá)陽性的SM22α-SMC為40.05%；經(jīng)ATRA誘導(dǎo)分化10 d及嘌呤霉素篩選3d的SPIE-ESC，EGFP表達(dá)陽性的

16、SM22α-SMC為98.99%。 4.SM22α-SMC表達(dá)平滑肌特異性標(biāo)志物:免疫熒光染色結(jié)果顯示SM22α-SMC表達(dá)平滑肌特異性標(biāo)志物SMα-actin和SM-MHC。且所有細(xì)胞SM22α染色強(qiáng)陽性。細(xì)胞呈SMC樣形態(tài)，具有發(fā)育良好的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維網(wǎng)。免疫印跡分析顯示，純化的SM22α-SMC組SM22α蛋白表達(dá)水平與大鼠主動(dòng)脈SMC組相當(dāng)，并高于未純化組；純化的SM22α-SMC組SM-MHC的表達(dá)水平高于未純化組，

17、但低于大鼠主動(dòng)脈SMC組；三組SMα-actin表達(dá)水平相當(dāng)。 5.卡巴可刺激SM22α-SMC收縮:卡巴可處理后，SM22α-SMC收縮明顯，細(xì)胞面積減少28±6.4%。而SVEC對(duì)卡巴可無反應(yīng)。 6.SM22α-SMC能夠整合到Matrigel中形成的管腔樣結(jié)構(gòu)中:SVEC單獨(dú)培養(yǎng)于Matrigel上在12 h及60 h可以形成管腔樣結(jié)構(gòu)。SM22α-SMC/SVEC共培養(yǎng)在同一時(shí)間點(diǎn)形成相似結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡下可見E