腫瘤相關(guān)microRNA及基因在胃腸道間質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床意義及其分子機(jī)制研究.pdf

1、[目的]結(jié)合小樣本高通量芯片篩選、生物信息學(xué)分析及臨床組織樣本驗(yàn)證，研究腫瘤相關(guān)微小核糖核酸（microRNA，miRNA）及基因在不同危險(xiǎn)度分級的胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinalstromaltumor,GIST）組織中的差異表達(dá)，評估候選miRNA及基因?qū)IST臨床病理分級及預(yù)后判斷的臨床價(jià)值，探討其對GIST細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及作用機(jī)制;研究神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，探討神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)分子在GIS

2、T組織中表達(dá)的臨床意義及其分子機(jī)制，為提高GIST的臨床診斷水平尋找新的突破點(diǎn)，為開發(fā)GIST治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　[方法](1)應(yīng)用miRCURYTMLNAArraymicroRNA表達(dá)譜芯片分析12例不同危險(xiǎn)度GIST組織標(biāo)本中microRNA差異表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)技術(shù)對篩選出的microRNA進(jìn)行功能分析，并對候選microRNAmiR-193a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測;應(yīng)用Taqman(R)qPCR法在福

3、爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE)的GIST組織與配對腫瘤旁組織中檢測miR-193a-3p的表達(dá)量，分析其在腫瘤與正常組織及不同危險(xiǎn)度腫瘤組織中的表達(dá)差異，并分析其與患者術(shù)后生存及腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)與方法，以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mimicmiR-193a-3p的GIST882細(xì)胞作為研究對象，探索miR-193a-3p對GIST882細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲等生物

4、學(xué)功能的影響;利用qPCR、western-blot及熒光素酶報(bào)告基因的手段驗(yàn)證miR-193a-3p對于靶基因KIT調(diào)控作用及其對相關(guān)下游信號通路的影響;通過建立GIST皮下成瘤裸鼠動(dòng)物模型;鑒定miR-193a-3p對GIST882細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響，通過體外細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，檢測miR-193a-3p對于GIST靶向藥物甲磺酸伊馬替尼(Imatinibmesylate，IM)作用的影響，評估其對GIST的潛在治療作用;(2)

5、應(yīng)用NimbleGenTMmicroarray分析12例不同危險(xiǎn)度GIST組織標(biāo)本中差異基因表達(dá)譜，聯(lián)合高通量表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnbius，GEO)分析篩選與GIST危險(xiǎn)度相關(guān)的差異基因，并應(yīng)用SYBR(R)GreenqPCR法在新鮮凍存的GIST組織中驗(yàn)證表達(dá)差異;構(gòu)建GIST組織芯片并用免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證篩選出的差異基因胞環(huán)蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（Anillin，ANLN）在GIST組織中的表達(dá)及其臨床意義

6、;(3)利用GIST表達(dá)譜芯片及組織芯片研究神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)分子在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，探討乙酰膽堿酯酶在胃腸道間質(zhì)瘤組織樣本中的表達(dá)及其臨床意義，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿及乙酰膽堿酯酶抑制劑對GIST882細(xì)胞增殖的影響。
　　[結(jié)果](1)microRNA表達(dá)譜芯片在12例不同危險(xiǎn)度GIST中篩選出27個(gè)與GIST危險(xiǎn)度相關(guān)的microRNA，通過生物信息學(xué)技術(shù)，結(jié)合Targetscan、miRanda、Pic

7、tar軟件分析預(yù)測其中的miR-193a-3p可能以KIT為靶基因;在20對FFPE的GIST組織及配對腫瘤旁組織中的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p在GIST組織中的表達(dá)量低于正常組織，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0205)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對94例不同危險(xiǎn)度分級的GIST組織檢測miR-193a-3p的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p的表達(dá)量隨著GIST腫瘤危險(xiǎn)度的升高而下調(diào)(P=0.0145);miR-193a-3p在GIST中的表

8、達(dá)高低與性別、年齡、腫瘤部位無顯著相關(guān)性，但與腫瘤大小(P=0.006)、核分裂相(P=0.004)及危險(xiǎn)度分級(P＜0.001)顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)miR-193a-3p表達(dá)與KIT表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(P=0.003);miR-193a-3p低表達(dá)組的5年無復(fù)發(fā)生存率顯著低于高表達(dá)組(30％vs72.1％，P=0.001)，同時(shí)miR-193a-3p低表達(dá)組的5年總生存率也顯著低于高表達(dá)組(63.7％vs85.6％，P=0.047);體外細(xì)

9、胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性miR-193a-3p可以顯著抑制GIST882細(xì)胞的增殖，從96h起即有顯著差異;同時(shí)miR-193a-3p可抑制GIST882細(xì)胞遷移及侵襲的能力，遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell)結(jié)果顯示mimicmiR-193a-3p組的穿透細(xì)胞數(shù)（14.40±1.208/高倍鏡視野）顯著低于mimicNC組（49.40±2.750/高倍鏡視野）(P＜0.0001)，侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)結(jié)果顯示mimicmiR-193

10、a-3p組的穿透細(xì)胞數(shù)（19.80±1.020/高倍鏡視野）同樣顯著低于mimicNC組（38.60±0.871/高倍鏡視野）(P＜0.0001);利用流式細(xì)胞儀檢測miR-193a-3p對GIST882細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)mimicmiR-193a-3p組細(xì)胞凋亡率13.63±0.45％，而mimieNC組為3.753±0.29％，兩者存在顯著差異(P=0.0044);裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射Agomir（經(jīng)化學(xué)修飾的穩(wěn)定miRNA激

11、動(dòng)劑）miR-193a-3p的GIST皮下移植腫瘤體積與AgomirNC組比較明顯縮小，注射10天后即有顯著差異，注射30天后收獲皮下腫瘤，發(fā)現(xiàn)AgomirmiR-193a-3p組皮下腫瘤質(zhì)量顯著小于AgomirNC組(0.0778gvs0.2252g，P＜0.001)。利用qPCR、western-blot和熒光素酶報(bào)告基因手段證實(shí)miR-193a-3p以KIT基因?yàn)榘谢虿ζ渲苯诱{(diào)控，發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p與NC相比可以顯著抑

12、制熒光素酶的活性(P＜0.01)，對轉(zhuǎn)染了mimicmiR-193a-3p48h后的GIST882與NC組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其KITmRNA表達(dá)下降了53.1％，KIT蛋白表達(dá)水平下降了67％;此外miR-193a-3p同時(shí)抑制KIT相關(guān)下游信號通路主要分子(AKT，MAPK，STAT3)的激活，AKT磷酸化水平下降了33％，MAPK磷酸化水平下降了13％，STAT3磷酸化水平下降了43％;通過體外細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)mimicmiR-

13、193a-3p組對IM的IC50濃度(0.312uM)明顯低于mimicNC組(1.345uM)，兩者存在顯著差異(P＜0.05);(2)利用基因表達(dá)譜芯片及GEO數(shù)據(jù)庫芯片結(jié)果篩選出可能與GIST危險(xiǎn)度相關(guān)的10個(gè)編碼基因，利用qPCR在36例不同危險(xiǎn)度分級的GIST新鮮冰凍組織中驗(yàn)證其中四個(gè)基因ANLN、DPP4、PEG10、SPP1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)ANLN與DPP4的表達(dá)量在高危GIST中明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別0.016

14、與0.03）。通過在包含326例GIST組織的組織芯片中對ANLN進(jìn)行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)ANLN在GIST中顯著高表達(dá)，ANLN表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤部位存在密切關(guān)聯(lián)(P＜0.001)，并與腫瘤直徑(P＜0.001)、核分裂相(P=0.001)和腫瘤分級(P＜0.001)呈正相關(guān)，ANLN高表達(dá)組的5年無復(fù)發(fā)生存率顯著低于低表達(dá)組(64.6％vs85.6％，P＜0.001)，同時(shí)ANLN高表達(dá)組的5年總生存率也顯著低于低表達(dá)組(77.5％vs97

15、.4％，P=0.003);3)通過對GIST表達(dá)譜芯片的分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)基因在GIST組織中存在恒定表達(dá)，通過在包含326例GIST組織的組織芯片中對重要神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)分子乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACHE）進(jìn)行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)ACHE表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤部位存在密切關(guān)聯(lián)(P＜0.001)，與腫瘤大小(P＜0.001)及危險(xiǎn)度分級(P＜0.001)正相關(guān)，ACHE高表達(dá)組5年總生存率顯著低于低表達(dá)組

16、(83.4％vs91％，P=0.033)，ACHE高表達(dá)組5年無復(fù)發(fā)生存率也顯著低于低表達(dá)組(81.4％vs67.8％，P=0.026)。使用不同濃度梯度的乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)及乙酰膽堿酯酶抑制劑新斯的明(Neostigmine，Neo)處理GIST882細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ach及Neo都能夠顯著抑制GIST882細(xì)胞的增殖能力，96h后即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　[結(jié)論](1)miR-193a-3p在GIST組織中顯

17、著低表達(dá)，且其表達(dá)量與GIST危險(xiǎn)度分級、腫瘤大小、核分裂相密切相關(guān)，與KIT表達(dá)強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，miR-193a-3p低表達(dá)提示GIST患者總生存率及無復(fù)發(fā)生存率低;外源性miR-193a-3p可以顯著抑制GIST882細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)抑制GIST882細(xì)胞成瘤性;miR-193a-3p能夠直接負(fù)調(diào)控靶基因KIT表達(dá)，并抑制KIT相關(guān)下游信號通路的激活，同時(shí)miR-193a-3p能夠顯著提高GIST882細(xì)

18、胞對靶向藥物IM的敏感性。(2)胞環(huán)蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（Anillin,ANLN）在高危GIST中表達(dá)量明顯上調(diào)，其表達(dá)與GIST臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，并可能用于輔助評估GIST患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后。(3)乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACHE）表達(dá)與GIST臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，并可能用于輔助評估GIST患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后，乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)及乙酰膽堿酯