以MEF2為靶點(diǎn)的小分子化合物CC1007在體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠模型中的抗肝癌作用.pdf

1、第一章 CC1007對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響和體內(nèi)抗腫瘤活性
　　目的:研究CC1007對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響和體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　方法:以不同濃度的CC1007干預(yù)肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞一定時(shí)間，采用MTT法分析細(xì)胞增殖或存活;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布;利用Hoechst染色及流式細(xì)胞儀（AnnexinⅤ/PI雙染法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CC1007體內(nèi)的抗肝癌作用。

2、>　　結(jié)果:
　　1.CC1007呈時(shí)間和濃度依賴的抑制各組肝癌細(xì)胞生存率（各組間比較P＜0.05）。40μM的CC1007干預(yù)72 h后，HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7細(xì)胞的存活率分別為（8.2±4.04）％、（2.3±1.78）％、(12.5±7.25)％、（6.6±5.03）％，而成纖維細(xì)胞的生存率為（61.1±4.19）％（與各肝癌細(xì)胞比較，P＜0.05）;CC1007干預(yù)72 h，HepG2、PLC

3、/PRF、Huh7、Hep3B細(xì)胞以及皮膚成纖維細(xì)胞的IC50分別為27.1μM、2.6μM、12.12μM、5.6μM和＞40μM。
　　2.CC1007干預(yù)24 h后，HepG2細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例升高、S期細(xì)胞比例下降。對(duì)照組(1‰DMSO)、10μM、20μM及40μM組G0/G1期細(xì)胞比例分別為61.1％、79.4％、80.2％、77.8％，S期細(xì)胞比例分別為28.5％、12.1％、12.6％、19.3％。
　

4、　3.Hoechst33258染色結(jié)果顯示CC1007干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h后，HepG2細(xì)胞核呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)改變。AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)胞凋亡結(jié)果顯示CC1007干預(yù)48 h后，細(xì)胞凋亡率隨著濃度而升高，40μM CC1007干預(yù)48 h后， HepG2、PLC/PRF/5、Huh7、Hep3B細(xì)胞的凋亡率分別為（41.43±1.7）％(與對(duì)照組比較，P＜0.05)、（70.46±10.48）％(與對(duì)照組比較，P＜0

5、.05)和（23.63±2.68）％(與對(duì)照組比較，P＜0.05)、（20.23±2.97）％(與對(duì)照組比較，P＜0.05)。
　　4.50mg/kg/d的CC1007對(duì)裸鼠皮下移植瘤體積的抑制率為55.4％(n=5，P＜0.05)，而對(duì)小鼠體重沒有影響。
　　結(jié)論:
　　1.CC1007對(duì)肝癌細(xì)胞具有選擇性抑制作用，CC1007呈濃度和時(shí)間依賴性的降低肝癌細(xì)胞存活率，而成纖維細(xì)胞對(duì)CC1007的耐受性高于腫瘤細(xì)胞。<

6、br>　　2.CC1007阻滯HepG2細(xì)胞周期于G0/G1期;10μM濃度的CC1007即能有效地阻滯細(xì)胞周期。
　　3.CC1007能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　4.CC1007能夠抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)。
　　第二章 CC1007抗肝癌機(jī)制的初步探討
　　目的:初步探討CC1007抗肝癌的作用機(jī)制
　　方法:CC1007干預(yù)肝癌細(xì)胞一定時(shí)間后，采用Westren blot法檢測(cè)乙?；疕3(Ace-H3

7、)、乙?；疕4(Ace-H4); RT-PCR、Westren blot法檢測(cè)周期抑制蛋白p21的表達(dá);RT-PCR、Westren blot法檢測(cè)Nur77的表達(dá);Caspase3/7 assay及Westren blot檢測(cè)Caspase的活化。
　　結(jié)果:
　　1.CC1007干預(yù)肝癌細(xì)胞24 h后，HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7細(xì)胞的Ace-H3、Ace-H4表達(dá)均增加。
　　2.CC10

8、07干預(yù)肝癌細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞p21的mRNA和蛋白表達(dá)量都增加。
　　3.不同濃度CC1007干預(yù)肝癌細(xì)胞30h后，Caspase3/7 assay發(fā)現(xiàn)HepG2、PLC/PRF/5細(xì)胞的Caspase3/7被激活，進(jìn)一步的Westrenblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Caspase9和Caspase3被活化，而Caspase8沒有被激活。
　　4.CC1007干預(yù)肝癌細(xì)胞20 h后，RT-PCR顯示Nur77mRNA表達(dá)升高;干預(yù)2

9、4 h小時(shí)后Westren blot顯示Nur77蛋白表達(dá)升高。
　　結(jié)論:
　　1.CC1007能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞組蛋白乙?；皆黾印?br>　　2.CC1007誘導(dǎo)p21表達(dá)增加可能參與細(xì)胞周期阻滯。
　　3.CC1007激活內(nèi)源性凋亡通路。
　　4.CC1007誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因子Nur77的表達(dá)。
　　第三章 Nur77在CC1007誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用
　　目的:探討Nur77在CC1007

10、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用
　　方法:CC1007干預(yù)HepG2細(xì)胞一定時(shí)間后，采用免疫熒光法激光共聚焦檢測(cè)Nur77在細(xì)胞內(nèi)的定位變化;采用western blot檢測(cè)Nur77在胞漿和胞核的表達(dá)變化;建立穩(wěn)定干擾Nur77的HepG2細(xì)胞株，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率、hoechst染色計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞比例、流式細(xì)胞儀檢測(cè)SubG1期細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光激光共聚焦顯示40μM的CC1007干預(yù)24 h

11、后，HepG2細(xì)胞中Nur77表達(dá)量升高，濃聚于細(xì)胞核;干擾30h后，Nur77主要定位于胞漿并且與線粒體存在共定位。
　　2.Western blot顯示:40μM的CC1007干預(yù)24 h后，細(xì)胞核內(nèi)Nur77表達(dá)升高，細(xì)胞漿內(nèi)Nur77表達(dá)量不變;干預(yù)30 h后，細(xì)胞核內(nèi)Nur77表達(dá)下降，細(xì)胞漿內(nèi)Nur77表達(dá)升高。
　　3.40μM的CC1007干預(yù)Nur77干擾組和對(duì)照干擾組細(xì)胞30 h后，MTT顯示存活率為分別

12、為（77.4±2.7）％和（63.4±0.8）％(P＜0.05)，Hoechst染色計(jì)數(shù)顯示凋亡率分別為（43.1±1.8）％和（52.13±0.5）％(P＜0.05)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示sub-G1期細(xì)胞比例分別為（24.04±2.8）％和（30.4±2.0）％(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.CC1007誘導(dǎo)HepG2凋亡過程中首先細(xì)胞核內(nèi)Nur77蛋白表達(dá)量升高，隨后Nur77出細(xì)胞核至細(xì)胞漿和線粒體。