天然小分子化合物小檗胺抗慢性粒細胞白血病作用靶分子鑒定及其作用機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種發(fā)生于造血干細胞水平的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病,在我國CML占總白血病發(fā)病率的20％左右。CML患者的骨髓細胞中可檢測到特異性的Ph染色體,它是由于t(9；22)(q34；q11)染色體易位形成的,從而導致BCR-ABL基因融合并表達210KD的BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL蛋白在慢性粒細胞白血病細胞惡性增殖過程中發(fā)揮著

2、重要作用,因而成為Ph+慢性粒細胞白血病的重要治療靶點。第一代以BCR-ABL蛋白為靶標的分子靶向藥物-伊馬替尼(Imatinib,IM)已成為治療CML的一線藥物。然而,令人遺憾的是,伊馬替尼類分子靶向藥物不能完全清除患者體內(nèi)BCR-ABL陽性白血病細胞克隆,并不能使多數(shù)CML患者獲得長期緩解,停藥后很快復發(fā),其中一些患者對伊馬替尼類分子靶向藥物產(chǎn)生耐藥。并且,越來越多的臨床和實驗研究資料顯示,單用分子靶向藥物只能控制慢性期CML,而

3、對加速期和急變期CML基本無效,更不能治愈CML。隨著近年來不斷深入的研究,揭示白血病干細胞(leukemia stem cell,LSC)是白血病復發(fā)和耐藥的主要根源,而伊馬替尼類分子靶向藥物對白血病干細胞無效。因為白血病干細胞通常處在休眠狀態(tài),很難被伊馬替尼類分子靶向藥物和經(jīng)典化療藥物清除,從而留下白血病復發(fā)根源。CML患者要獲得長期緩解和治愈,不僅需要殺死快速增殖的白血病細胞,而且還要清除處在休眠期的白血病干細胞。已有研究表明很多

4、蛋白,如β-catenin,NF-κB等分子,與白血病干細胞的存活、自我更新和凋亡抵抗有關(guān)。但是這些分子在正常造血干細胞中也起著相似的作用,沒有明顯的特異性。因此,鑒定白血病干細胞特異性的蛋白靶標,并繼而研發(fā)新型分子靶向藥物就顯得十分迫切。
　　 小檗胺(Berbamine,BBM)是從我國中草藥小檗屬植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿藥物。多年來一直廣泛應用于臨床,如抗炎和白細胞減少的治療。我們前期研究結(jié)果顯示,在體外小檗胺

5、可以有效抑制對伊馬替尼耐藥的CML細胞的增殖,但對正常造血細胞增殖沒有明顯抑制作用。這表明小檗胺很可能對CML干細胞具有特異性殺傷作用,這將對CML的根治具有重要的臨床意義。因此本研究將對其具體作用機制進行初步探討。
　　 研究目的:
　　 1、研究天然小分子化合物小檗胺(BBM)對裸鼠慢性粒細胞白血病細胞移植瘤的清除作用。
　　 2、篩選并鑒定BBM抗慢性粒細胞白血病作用的靶分子。
　　 3、闡明該靶分

6、子調(diào)控慢性粒細胞白血病干細胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子機制,從而明確BBM對慢性粒細胞白血病細胞清除作用的內(nèi)在分子機制。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1天然小分子化合物小檗胺(BBM)對裸鼠慢性粒細胞白血病細胞移植瘤的清除作用研究
　　 我們分別用急變期CML細胞敏感株K562-S和耐受伊馬替尼(IM)的耐藥株K562-R(經(jīng)流式細胞儀測定含1-2％CD34+白血病干細胞)建立裸鼠荷瘤模型。結(jié)果顯示,荷瘤裸鼠連續(xù)

7、口服小檗胺(150mg／kg,每天1次)10天后,70％(14／20)K562-S白血病細胞異種移植瘤完全消退；荷瘤裸鼠連續(xù)口服小檗胺(100mg／kg,每天3次)10天后,其體內(nèi)伊馬替尼耐藥的K562-R白血病細胞移植瘤抑制率達到90.91％(10／11)。而且在實驗觀察期間沒有發(fā)現(xiàn)明顯的藥物毒副作用。
　　 2小檗胺抗慢性粒細胞白血病作用靶分子CaMKⅡγ激酶的鑒定
　　 本部分聯(lián)合應用小檗胺親和基質(zhì),蛋白質(zhì)譜和We

8、stern blot技術(shù)方法發(fā)現(xiàn)并證實:BBM能與活化的鈣離子／鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱγ(Calcium／calmodulin-dependent protein kinaseⅡγ,簡稱CaMKⅡγ)發(fā)生特異性作用。進一步應用計算機分子對接模型(molecular docking model)模擬顯示小檗胺主要以范德華力(van der Waals forces)與CaMKⅡγ激酶P44,V47,I64,V93,P109,V112和L1

9、62氨基酸殘基結(jié)合,并且其位置正好位于CaMKⅡγ激酶的ATP結(jié)合袋(ATPbinding pocket)。而Western blot結(jié)果顯示BBM處理白血病細胞后,CaMKⅡγ的磷酸化水平(pCaMKⅡγ)顯著降低,而CaMKⅡγ總蛋白水平?jīng)]有明顯變化。這提示小檗胺很可能通過與ATP競爭性結(jié)合CaMKⅡγ激酶而抑制其磷酸化水平。
　　 3 CaMKⅡγ激酶調(diào)控慢性粒細胞白血病干細胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子機制研究

10、　　 3.1 CaMKⅡγ激酶在CD34+血病細胞中特異性異常激活
　　 應用流式細胞分選技術(shù)分選出CML干細胞,用Western blot技術(shù)對其CaMKⅡγ激酶表達水平進行檢測和分析。并檢測CaMKⅡγ激酶在CML干細胞與正常造血干細胞中的表達水平。發(fā)現(xiàn)CaMKⅡγ激酶在CD34+的CML干細胞中呈特異性高表達,并且其磷酸化水平也較高,而在相應CD34-的CML細胞和正常造血干細胞中表達水平很低。
　　 3.2 C

11、aMKⅡγ激酶與CML干細胞的存活密切相關(guān),且促進LSC的自我更新
　　 應用特異性反義核酸下調(diào)K562細胞CaMKⅡγ激酶表達水平,觀察對細胞增殖的影響,結(jié)果顯示,下調(diào)CaMKⅡγ激酶表達水平后,白血病克隆形成能力被明顯抑制。利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)K562細胞CaMKⅡγ激酶表達水平,觀察CD34+的干細胞數(shù)目,以及對克隆形成能力的影響。發(fā)現(xiàn)上調(diào)CaMKⅡγ激酶表達水平可以增加CD34+的干細胞比例以及增強細胞克隆形成能力。

12、r>　　 3.3 CaMKⅡγ激酶促進裸鼠CML異種移植瘤的成瘤能力
　　 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP的K562細胞分別接種至同一只裸鼠兩側(cè)皮下。通過比較兩側(cè)異種移植瘤的大小來觀察上調(diào)CaMKⅡγ激酶水平對白血病細胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示CaMKⅡγ激酶高表達可以增強K562細胞裸鼠異種移植瘤成瘤能力。且發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CaMKⅡγ的K562細胞裸鼠異種移植腫瘤中,干細胞樣的原

13、始腫瘤細胞數(shù)量顯著高于對照組。
　　 3.4 CaMKⅡγ激酶促進慢性粒細胞白血病干細胞存活,自我更新和凋亡抵抗的機制
　　 通過Western blot技術(shù)檢測,CaMKⅡγ激酶高表達對與LSC存活、自我更新和凋亡抵抗密切相關(guān)的重要信號分子蛋白β-catenin、GSK3β和Caspase-2等表達水平的影響。結(jié)果顯示,穩(wěn)定高表達CaMKⅡγ的K562細胞中,p-GSK和β-catenin的蛋白表達水平顯著升高,Cas

14、pase-2的表達水平明顯下降。而且流式分選結(jié)果顯示CML患者骨髓細胞中CD34+的CML干細胞內(nèi)β-catenin蛋白高表達。提示CaMKⅡγ激酶可能通過磷酸化GSK3導致其活性被抑制,進而解除GSK3對β-catenin的抑制作用,最終實現(xiàn)對Wnt／β-Catenin信號通路正調(diào)控,促進LSC存活和自我更新；另一方面可能通過抑制Caspase-2活性,使細胞產(chǎn)生凋亡抵抗。
　　 3.5 CaMKⅡγ激酶可能是調(diào)控GSK3／W

15、nt／β-catenin和線粒體／Caspase-2信號通路的重要分子開關(guān),且能與GSK3分子形成信號轉(zhuǎn)導復合體
　　 本部分實驗通過免疫共沉淀的方法,進一步鑒定及證實慢性粒細胞白血病干細胞內(nèi)CaMKⅡγ激酶主要信號轉(zhuǎn)導復合體的核心組分。結(jié)果顯示,應用CaMKⅡγ激酶特異性抗體進行免疫共沉淀CaMKⅡγ激酶相關(guān)信號轉(zhuǎn)導復合體,用Westernblot技術(shù)驗證出在該復合體中存在β-catenin、GSK3／β和Caspase-2蛋

16、白。應用GSK3／β特異性抗體進行免疫共沉淀,并用Western blot技術(shù)驗證出CaMKⅡγ蛋白能和GSK3／β結(jié)合。以上結(jié)果表明CaMKⅡγ激酶可能是調(diào)控GSK3／Wnt／β-catenin和線粒體／Caspase-2信號通路的重要分子開關(guān),且能與GSK3分子形成信號轉(zhuǎn)導復合體。
　　 3.6 CaMKⅡγ激酶抑制劑BBM對K562-R細胞中干細胞相關(guān)重要分子β-catenin表達水平的抑制作用
　　 采用West

17、ern blot技術(shù)檢測BBM作為CaMKⅡγ激酶抑制劑,是否可以抑制LSC中與存活,自我更新和凋亡抵抗密切相關(guān)的重要信號分子β-catenin蛋白表達水平。結(jié)果顯示,BBM可以顯著抑制慢性粒細胞白血病細胞K562-R的β-catenin蛋白表達水平。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、小檗胺不僅殺滅裸鼠體內(nèi)增殖活躍的人慢性粒細胞白血病細胞,還可能清除處在休眠狀態(tài)的慢性粒細胞白血病干細胞,并且在治療劑量下小檗胺對裸鼠沒有明顯的

18、毒副作用。
　　 2、CaMKⅡγ激酶是小檗胺抗慢性粒細胞白血病作用的靶分子。小檗胺能特異性結(jié)合CaMKⅡγ激酶的ATP結(jié)合袋結(jié)構(gòu)域,并抑制CaMKⅡγ的磷酸化。
　　 3、CaMKⅡγ激酶可能是調(diào)控GSK3／Wnt／β-catenin和線粒體／Caspase-2信號通路的重要分子開關(guān)。CaMKⅡγ通過磷酸化GSK3導致其活性被抑制,進而解除GSK3對β-catenin的抑制作用,最終實現(xiàn)對Wnt／β-Catenin信號