miR-17-5p-20a在胃癌診斷中的應用及其作用機制研究.pdf

1、目的：miR-17-5p和miR-20a(miR-17-5p/20a)在多種腫瘤中表達失調(diào)，但是其在胃癌組織中的表達情況、臨床意義、作用機制以及在胃癌診斷、療效監(jiān)測及預后判斷方面的應用尚不清楚。本研究旨在揭曉胃癌組織中miR-17-5p/20a表達的臨床意義，揭示miR-17-5p/20a在胃癌發(fā)展中的功能，闡明miR-17-5p/20a對胃癌細胞作用的分子機制，明確循環(huán)miR-17-5p/20a在胃癌診斷與治療中的用價值。
　　

2、 方法：采用定量RT-PCR檢測157例胃癌組織和相應癌旁組織中miR-17-5p/20a的表達，結(jié)合臨床病理資料分析其臨床表達意義。以胃黏膜上皮細胞株GES-1為對照，比較胃癌細胞株(HGC-27，BGC-823，SGC-7901和AGS)中miR-17-5p/20a的表達水平。選擇低表達miR-17-5p/20a的胃癌細胞轉(zhuǎn)染miRNA mimics使之過表達，選擇高表達的胃癌細胞轉(zhuǎn)染miRNA inhibitors抑制其表達，通

3、過細胞計數(shù)、平板克隆、流式分析細胞周期、TUNEL檢測細胞凋亡及Western blot檢測增殖凋亡相關(guān)蛋白，分析miR-17-5p/20a在胃癌細胞中的功能。體內(nèi)建立BALB/c裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，采用antagomir-17-5p和antagomir-20a瘤內(nèi)定點注射治療，測量瘤體大小并繪制瘤體生長曲線，通過定量RT-PCR檢測瘤組織內(nèi)miR-17-5p/20a的表達、病理切片TUNEL檢測細胞凋亡及Western blot檢

4、測增殖凋亡相關(guān)蛋白觀察體內(nèi)靶向抑制miR-17-5p/20a對胃癌治療的效應。采用TargetScan和PicTar生物信息軟件預測、野生型和突變型靶基因3‘UTR熒光素酶報告基因構(gòu)建與檢測、定量RT-PCR和Western blot驗證檢測明確miR-17-5p/20a調(diào)控的靶基因。Western blot檢測分析胃癌組織和癌旁組織中靶基因蛋白與miR-17-5p/20a表達水平的相關(guān)性，MDM2干擾片段或表達載體與miRNA mim

5、ics共轉(zhuǎn)染闡明miR-17-5p/20a在胃癌發(fā)展中的調(diào)控分子機制。收集65例胃癌患者術(shù)前、16例術(shù)后和6例復發(fā)患者血漿標本，14例配對的胃癌術(shù)前和術(shù)后血漿標本，90例健康志愿者血漿標本作對照。采用定量RT-PCR比較循環(huán)miR-17-5p/20a表達量，結(jié)合術(shù)前患者病理資料分析其臨床意義以及與病程相關(guān)性。隨訪并記錄術(shù)前患者生存率，采用Kaplan-Meier、logrank test、單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析循環(huán)mi

6、R-17-5p/20a在胃癌預后預測中的價值。定量RT-PCR檢測antagomir-17-5p/20a治療前后BALB/c裸鼠血清中循環(huán)miR-17-5p/20a表達的改變，評估循環(huán)miR-17-5p/20a在療效監(jiān)測中的應用。
　　 結(jié)果：建立了miR-17-5p/20a定量RT-PCR檢測方法，胃癌組織中miR-17-5p/20a的表達僅與胃癌體積大小相關(guān)。miR-17-5p/20a在胃癌細胞AGS中表達水平最低，而在SG

7、C-7901中表達最高。選擇AGS和SGC-7901分別進行過表達和低表達試驗研究。miR-17-5p/20a過表達可增加胃癌細胞數(shù)量，促進細胞提前進入S期，減少凋亡細胞數(shù)并上調(diào)CDK2、磷酸化ERK(p-ERK)和BCL2的表達，抑制Caspase3的活化。miR-17-5p/20a低表達抑制細胞平板克隆形成，誘導細胞周期阻滯于G1/G0期，增加凋亡細胞數(shù)量并伴有CDK2、p-ERK和BCL2的表達下調(diào)，活化了Caspase3。與PB

8、S和antagomir陰性片段對照組相比，體內(nèi)antagomir-17-5p/20a治療組腫瘤體積小且生長速度受到抑制，瘤組織內(nèi)miR-17-5p/20a的表達顯著降低，并伴有CDK2、p-ERK和BCL2表達的下調(diào)及Caspase3活化。生物信息學軟件預測結(jié)合實驗研究驗證并確定miR-17-5p/20a通過與mRNA3’UTR位點結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平靶向負調(diào)控p21和TP53INP1。胃癌組織中miR-17-5p/20a與其靶基因TP53

9、INP1的蛋白表達成負相關(guān)，而與p21蛋白表達水平不成負相關(guān)。但這些組織中MDM2與p21蛋白表達水平卻始終成負相關(guān)性。MDM2的表達可隨著miR-17-5p/20a表達升高而增加，同時又可隨著miR-17-5p/20a表達降低而減少。MDM2的低表達可以逆轉(zhuǎn)miR-17-5p/20a對p21的抑制作用及消除其過表達后促進細胞提前進入S期，減少凋亡細胞的數(shù)量并上調(diào)CDK2、p-ERK和BCL2的表達，抑制Caspase3的活化的作用。M

10、DM2的表達恢復又可以一定程度上恢復miR-17-5p/20a過表達后對p21的抑制作用和促進胃癌細胞增殖的功能，援救MDM2低表達對其帶來的損害。術(shù)前循環(huán)miR-17-5p/20a表達水平與胃癌細胞的分化程度和TNM分期密切相關(guān)。與術(shù)前表達水平比較，術(shù)后循環(huán)miR-17-5p/20a表達明顯降低，而復發(fā)患者中的表達量增加并接近術(shù)前表達水平。Kaplan-Meier、logrank test和單因素Cox比例風險回歸分析顯示高表達循環(huán)m

11、iR-17-5p/20a的患者預后差。多因素Cox比例風險回歸模型分析發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-20a可作為獨立的危險預測因子進行預后判斷。體內(nèi)裸鼠治療模型結(jié)果顯示antagomirs治療組血清中miR-17-5p/20a的表達逐漸下調(diào)。
　　 結(jié)論：miR-17-5p/20a通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制p21和TP53INP1的表達，加速胃癌細胞周期進程和抑制細胞凋亡來促胃癌細胞增殖。MDM2是miR-17-5p/20a負向調(diào)控p21和功能發(fā)揮的