MiR-590-5P在肝癌細(xì)胞中作用的初步研究.pdf

1、第一部分、MiR-590-5P和S100A10的表達(dá)及關(guān)系分析
　　 目的：探討miR-590-5P和S100A10基因在人肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　 方法：培養(yǎng)人正常的肝細(xì)胞及多種肝癌細(xì)胞株，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，Trizol法提取TotalRNA，使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，設(shè)計(jì)針對(duì)成熟體miR-590-5P的PCR檢測(cè)引物，熒光定量法檢測(cè)成熟體miR-590-5P含量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，抽提細(xì)

2、胞總蛋白，BCA蛋白定量，Westernblot檢測(cè)S100A10蛋白含量。分析miR-590-5P及S100AA10在肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：熒光定量檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-590-5P在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá)(與正常肝細(xì)胞比較，p＜0.01);S100A10蛋白含量則在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 結(jié)論：miR-590-5P在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá),S100A10基因在人肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，二者之間存在負(fù)相關(guān)

3、趨勢(shì)。
　　 第二部分、MiR-590-5P與S100A10間調(diào)控關(guān)系分析
　　 目的：分析miR-590-5P與S100A10表達(dá)之間可能存在的調(diào)控關(guān)系。
　　 方法：提取人基因組DNA，PCR擴(kuò)增miR-590-5P前體序列，構(gòu)建pcDNA-miR-590-5P重組質(zhì)粒。提取人TotalRNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PCR擴(kuò)增S100A10基因的3'UTR區(qū)，將S100A10的3'UTR區(qū)克隆到PGL3-pro

4、moter熒光素酶表達(dá)載體，構(gòu)建pS100A10-3’UTR-PGL3重組質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將報(bào)告基因重組載體及miRNA重組載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，使用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為參照，檢測(cè)細(xì)胞干預(yù)前后熒光素酶的變化趨勢(shì)。若miR-590-5P能夠抑制pS100A10-3’UTR-PGL3報(bào)告基因的螢光素酶表達(dá)，則采用點(diǎn)突變的方法使S100A10-3’UTR中位于miR-590-5P上的結(jié)合位點(diǎn)即種子序列發(fā)生堿基突變，

5、然后通過檢測(cè)，觀察其抑制作用是否還繼續(xù)存在或消失。將慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锛爸亟M表達(dá)載體pcDNA-miR-590-5P共轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細(xì)胞系(293T)，采用Lv-miR-590-5P重組慢病毒進(jìn)行包裝和生產(chǎn)，同時(shí)采用比例稀釋法來檢測(cè)其病毒滴度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定研究中慢病毒感染HepG2細(xì)胞的最佳MOI值。以最佳MOI值使用慢病毒顆粒對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行感染，在感染72h后，檢測(cè)HepG2細(xì)胞的感染效率，然后收集HepG2細(xì)胞，再分別提

6、取其總RNA和總蛋白，采用RT-PCR和Westernblot的方法檢測(cè)miR-590-5P和S100A10之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pcDNA-miR-590-5P重組表達(dá)載體及pS100A10-3’UTR-PGL3報(bào)告基因重組質(zhì)粒。在293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-miR-590-5P，可以抑制pS1OOA10-3’UTR-PGL3載體表達(dá)熒光素酶，而當(dāng)3’-UTR進(jìn)行突變修飾后，pmir-590-5P不能夠抑制其表達(dá)

7、。通過慢病毒系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中高效表達(dá)mir-590-5P，細(xì)胞中mir-590-5P的過表達(dá)抑制了S100A10基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：S100A10為miR-590-5P的靶基因。在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-590-5P,可以抑制SIOOAlO基因表達(dá)。
　　 第三部分、MiR-590-5P對(duì)于肝癌細(xì)胞HepG2的影響
　　 目的：通過慢病毒途徑在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-590-5P，觀察基因干預(yù)對(duì)于

8、細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞周期，鈣離子濃度，細(xì)胞侵襲能力及相關(guān)蛋白含量的影響。
　　 方法：使用重組慢病毒Lv-miR-590-5P和對(duì)照病毒Lv-GFP，以最佳MOI值感染HepG2細(xì)胞，感染后72h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，通過綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)判斷細(xì)胞的感染效率。取病毒感染后的細(xì)胞，胰酶消化的方法制備細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞到96孔板中，正常條件培養(yǎng)24、48、72h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。收集病毒感染后72h細(xì)胞，臺(tái)酚

9、藍(lán)細(xì)胞染色后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，正常條件培養(yǎng)24h，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，然后使用75％乙醇固定細(xì)胞24h，Rnase處理細(xì)胞，PI染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。感染后72h，胰酶消化的方法制備細(xì)胞懸液，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力變化。取病毒感染后的細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)細(xì)胞染色后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，正常條件培養(yǎng)24h，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，進(jìn)行鈣離子濃度檢測(cè)。取病毒感染后的細(xì)胞，采用胰酶消化的方法將其

10、制備成一定濃度的細(xì)胞懸液，再將接種細(xì)胞置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在正常條件下培養(yǎng)接種細(xì)胞24h，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)蛋白含量檢測(cè)。使用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。使用Westernblot檢測(cè)WNT通路相關(guān)蛋白（WNT5a、E-cadherin、Caspase3、cMyc、CyclinD1、MMP7）含量，及β-catenin蛋白磷酸化程度。并使用光密度分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。
　　 結(jié)果：

11、通過慢病毒途徑，可以在肝癌細(xì)胞HepG2中獲得100%的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在肝癌細(xì)胞HepG2中過表達(dá)的miR-590-5P，不僅可以明顯抑制患者腫瘤細(xì)胞的增殖活性，還會(huì)引起其細(xì)胞周期發(fā)生停滯，進(jìn)而加劇對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的抑制作用。在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-590-5P，可明顯抑制WNT5a、cMyc、CyclinD1、MMP7蛋白表達(dá)，而促進(jìn)E-cadherin、Caspase3蛋白表達(dá)，同時(shí)，miR-590-5P的過表達(dá)可引起β-cat