Dravet綜合征患者體細(xì)胞重編程前后基因組微失衡的相關(guān)研究.pdf

1、Dravet綜合征又稱嬰兒重型肌陣攣性癲癇(severe myoclonic epilepsy in infancy,SME),是一種罕見的主要由遺傳因素引起的惡性癲癇綜合征,常伴有認(rèn)知損害及自閉癥傾向。具有發(fā)病年齡早、發(fā)作形式復(fù)雜、發(fā)作頻率高、智力損害嚴(yán)重、藥物治療有效率低、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn),是熱性驚厥疊加全面性癲癇附加征(GEFS+)中最嚴(yán)重的表型。分子遺傳學(xué)研究證實(shí)Dravet綜合征與電壓依賴性鈉通道a1-亞單位(volta

2、ge-gated sodium channel a1-subunit,SCN1A)基因突變密切相關(guān)。隨著比較基因組雜交技術(shù)(microarray comparative genome hybridization,aCGH)的發(fā)展,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在Dravet綜合征患者基因組中某些拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)與難治性癲癇密切聯(lián)系,涉及SCN1A、EPHA5等易感基因。隨著iPS技術(shù)的興起,為建立Drav

3、et綜合征體外模型提供了新的研究思路,減少了倫理、法律及免疫排斥等問題。目前很多研究建立的特定誘導(dǎo)分化體系中所使用的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)遺傳背景不一樣,因其細(xì)胞來源個(gè)體本身就存在顯著基因組差異。因此,研究干細(xì)胞基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。本研究選擇新型強(qiáng)大的細(xì)胞遺傳分析平臺(tái)—aCGH,準(zhǔn)確而快速地發(fā)掘和診斷CNVs;利用Dravet綜合征患者的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPS

4、Cs,分析這種疾病體細(xì)胞及相應(yīng)iPSCs的基因組CNVs。本研究表明,患者家系中SCN1A相同位點(diǎn)基因突變者的癥狀不盡一致,這些可能與各自存在不同的CNVs密切有關(guān)。體細(xì)胞存在與癲癇相關(guān)的致病性CNVs;通過重編程,早代iPSCs基因組狀態(tài)不穩(wěn)定,增加許多CNVs,該區(qū)域涉及與細(xì)胞循環(huán)、凋亡、腫瘤等相關(guān)的基因。
　　第一部分Dravet綜合征-iPS系的建立及其生物學(xué)特性鑒定
　　【研究目的】
　　了解患病家系SCN1

5、A基因突變情況及癥狀,重編程Dravet綜合征先證者成纖維細(xì)胞,獲得iPS細(xì)胞并進(jìn)行鑒定,為后續(xù)研究疾病的發(fā)生機(jī)制、誘導(dǎo)分化、藥物篩選及表觀遺傳學(xué)研究等方面提供良好的模型。
　　【研究方法】
　　1.測序驗(yàn)證先證者家系SCN1A基因突變情況。
　　2.收集Dravet綜合征先證者皮膚成纖維細(xì)胞并培養(yǎng)。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子重編程患者成纖維細(xì)胞,篩選出iPSCs,當(dāng)克隆形態(tài)較大時(shí)機(jī)械挑取進(jìn)行傳代。
　　3

6、.選取生長狀態(tài)良好的iPS克隆進(jìn)行多能性、體外分化、核型、STR及SCN1A基因突變的鑒定。
　　【結(jié)果】
　　1.先證者及其父親、弟弟均為SCN1A突變c.4284+2T>C。父子三人癥狀不同。
　　2.先證者成纖維細(xì)胞的培養(yǎng),可見組織塊邊緣有長梭形纖維細(xì)胞長出。先證者iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。感染后大約20天可獲得iPS細(xì)胞克隆。iPS細(xì)胞堿性磷酸酶染色為強(qiáng)陽性,鏡下見克隆中細(xì)胞密集區(qū)出現(xiàn)紫黑色顆粒,從AP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)iP

7、S細(xì)胞形成效率約為0.20％。
　　3.iPSCs能維持自我更新狀態(tài),具有與ES細(xì)胞相似的形態(tài)、多能性和體外分化能力,重編程前后其核型、STR位點(diǎn)及SCN1A基因突變與患者體細(xì)胞一致。
　　【結(jié)論】
　　1.本患病家系中SCN1A相同位點(diǎn)突變但癥狀輕重不同,可能與SCN1A的表達(dá)調(diào)控及其它癲癇相關(guān)基因突變或用藥狀況有關(guān)。該家系適合建立體外模型進(jìn)行機(jī)制研究。
　　2.成功建立一株Dravet綜合征iPS細(xì)胞系,為研

8、究疾病的發(fā)生機(jī)理、誘導(dǎo)分化、藥物篩選及表觀遺傳學(xué)研究等方面提供良好的細(xì)胞模型。
　　第二部分Dravet綜合征重編程前后基因組微失衡的相關(guān)研究
　　【研究目的】
　　1.分析Dravet綜合征家系中各受檢者基因組拷貝數(shù)的變異。
　　2.研究Dravet綜合征家系中父子三人癥狀差異與基因組拷貝數(shù)變異的關(guān)系。
　　3.研究重編程過程是否影響基因組穩(wěn)定性,進(jìn)一步探討iPS建系的有效性。
　　【研究方法】

9、r>　　1.利用高分辨率的Affymetrix CytoScan HD芯片檢測Dravet綜合征家系中不同患者,分析與癲癇癥狀相關(guān)的基因組拷貝數(shù)變異的關(guān)系。
　　2.利用高分辨率的Affymetrix CytoScan HD芯片檢測Dravet綜合征先證者的體細(xì)胞及早代iPS細(xì)胞,分析重編程后基因組CNVs及雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.Dravet綜

10、合征家系成員發(fā)現(xiàn)致病性CNVs,父子三人間CNVs不一致。該家系中,先證者父親具有中國漢族人群原發(fā)性癲癇的易感基因CACNA1H,先證者及其弟弟具有與Mg2+相關(guān)的基因SMPD4。
　　2.Dravet綜合征先證者體細(xì)胞與相應(yīng)iPSCs的LOH未發(fā)現(xiàn)明顯差異,iPSCs的CNVs明顯增多,且均為微重復(fù),涉及致癌基因。
　　【結(jié)論】
　　1.Dravet綜合征家系成員存在致病性CNVs,父子三人間CNVs不一致,與其癥狀