水稻黃單胞編碼HarpinXoo全長基因及其缺失片段轉基因煙草和有關表型的比較研究.pdf

1、大多數(shù)革蘭氏陰性植物病原細菌都存在hrp基因(hypersensitive response andpathogenicity)，其決定病原菌對感病寄主植物的致病性和非寄主植物的過敏反應。Harpin是一類由革蘭氏陰性植物病原細菌hrp基因編碼的蛋白質激發(fā)子，可以激發(fā)煙草過敏性細胞壞死(hypersensitive cell death，HCD)，誘導植物抗病、抗蟲，促進植物生長。hrfA(HR function)基因是本實驗室通過PC

2、R方法，從水稻黃單胞細菌白葉枯致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)JxoⅢ菌株中克隆到的。hrfA全長420 bp，編碼的harpinXoo具有其它harpin蛋白所共有的生物活性：激發(fā)煙草HR，誘導煙草對多種病原物的抗性。但是harpinXoo還顯示一些獨特性：富含甘氨酸(Gly)，同時也含有半胱氨酸(Cys)，分子量比其它已報道的harpin都小。本實驗室已成功將hrfA轉入煙草、水稻、棉花等

3、作物中，都不同程度地提高了轉基因植物的抗病能力。本實驗室李平通過PCR方法，克隆到hrfA基因的5個缺失突變基因AB、CD、EF、AD和CF，并在Escherichia coli中表達得到缺失多肽片段。HarpinXoo N-末端的AB片段仍保持誘導過敏反應和抗病性的能力；中部的CD多肽片段失去了誘導過敏反應的能力，但仍可以誘導抗病性，而且當CD與其它片段組合時，可增強它們的活性。所以推測CD可能在harpinXoo分子與植物相互識別的

4、過程中起著增強子的作用。因此，深入研究AB和CD兩個多肽片段的誘導抗病性機理將是有趣的理論問題。
　　 本研究將hrfA基因及其片段AB，CD分別從pET30a(+)∷hrfA，pET30a(+)∷AB，pET30a(+)∷CD中用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后回收，連接到用這兩個酶切過的轉基因表達載體pBI121上，構建成重組轉基因載體pB-hrf，pB-AB，pB-CD。重組載體轉化至大腸桿菌DH5α中，經測序驗證后，通過凍融

5、法轉化根癌土壤桿菌EHA105。經菌落PCR和酶切檢測后，挑選陽性克隆供轉化煙草使用。
　　 采用葉盤法轉化煙草(Nicotiana tobacum cv.Xanthi nc.)，用卡那霉素抗性篩選再生植株。通過PCR擴增檢測了轉化煙草中的靶基因序列及35S啟動子序列，對T1代PCR陽性植株進行了PCR-Southern雜交和RT-PCR分析。結果顯示外源基因已經整合到轉基因煙草基因組中，并且能在轉錄水平正常表達.從轉hrfA基

6、因和AB片段的煙草中提取的可溶性蛋白注射煙草能引起過敏反應，而轉CD片段的煙草蛋白則不能。
　　 在相同培養(yǎng)條件下，轉基因煙草的株高、葉片大小和花期等性狀與受體植株無明顯差異，生長發(fā)育正常，無肉眼可見的HR。用trypan blue對轉基因煙草葉片進行染色發(fā)現(xiàn)，轉基因表達harpinXoo及其AB多肽片段能夠誘導煙草產生micro-HR，而轉基因表達CD多肽片段不能誘導煙草產生micro-HR。抗病性鑒定結果表明，轉hrfA基因