腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活與脂代謝紊亂在腎損傷中的相互作用研究.pdf

1、目的:高血壓和高脂血癥是慢性腎臟病(choronic kidney disease，CKD)發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)激活是CKD腎性高血壓發(fā)生的主要機(jī)制之一。研究表明，RAS激活與高脂血癥在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)進(jìn)展中存在相互作用。然而，脂代謝紊亂與RAS激活在介導(dǎo)腎臟損傷中是否存在相互作用及可能的機(jī)制如何，目前尚不清楚。本研

2、究旨在通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，觀察脂代謝紊亂與RAS激活在介導(dǎo)腎臟損傷中的作用，并探討可能的作用機(jī)制。
　　 方法:將8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein Eknockout, ApoE-/-)小鼠隨機(jī)分為高脂飲食組(n=8)和普通飲食對(duì)照組(n=8)，8周后處死小鼠收集血漿標(biāo)本及腎臟組織標(biāo)本，觀察高脂血癥對(duì)腎臟局部RAS激活的影響及其在腎損傷中的作用;體外研究，脂質(zhì)刺激分別觀察其對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞(Huma

3、n proximaltubular epithelial cell line，HK-2)和人腎小球系膜細(xì)胞（Human mesangial cell，HMC）胞內(nèi)RAS的表達(dá)及其可能的作用機(jī)制;血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）刺激分別觀察其對(duì)HK-2和HMC胞內(nèi)脂質(zhì)堆積及脂代謝信號(hào)通路的影響。放免法檢測(cè)動(dòng)物血漿中循環(huán)RAS水平，臨床生化法檢測(cè)血漿脂質(zhì)譜，HE染色和Masson染色評(píng)估腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及胞外基質(zhì)堆積，MT

4、T及流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖情況，油紅O染色及化學(xué)酶促-比色法觀察胞內(nèi)中脂質(zhì)積聚情況，免疫組化、免疫熒光染色檢測(cè)腎臟組織及細(xì)胞中蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot法檢測(cè)組織及細(xì)胞內(nèi)RAS成分、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)因子E-cadherin，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)和fibronectin、胞外基質(zhì)、低密度脂蛋白受體(low densitylipoprotein rec

5、eptor, LDLr)脂代謝信號(hào)通路以及雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin, mTOR)信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)。
　　 結(jié)果:1）與對(duì)照組比，高脂飲食組小鼠血脂水平明顯升高，伴有腎小管間質(zhì)胞外基質(zhì)堆積增多。除血漿前腎素水平明顯低于對(duì)照組外，其它指標(biāo)，如血漿腎素、血管緊張素Ⅰ及AngⅡ水平兩組間無(wú)明顯差異。進(jìn)一步研究顯示，腎臟局部RAS成分蛋白表達(dá)均明顯升高，與血脂水平呈正相關(guān)，與誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞

6、EMT呈正相關(guān)。2）脂質(zhì)刺激HK-2、HMC后，胞內(nèi)RAS成分表達(dá)明顯增多，提示胞內(nèi)RAS活化。同時(shí)，HK-2 E-cadherin mRNA及蛋白水平較對(duì)照組降低，而α-SMA和fibronectin水平較對(duì)照組升高，促進(jìn)HMC增殖，胞外基質(zhì)表達(dá)增加，提示細(xì)胞發(fā)生功能改變。進(jìn)一步研究顯示，胞內(nèi)mTOR, S6k1和4EBP1基因的表達(dá)及磷酸化狀態(tài)蛋白水平明顯升高，提示mTOR信號(hào)通路激活可能參與了脂質(zhì)刺激的細(xì)胞增殖。3）AngⅡ刺激后

7、，HK-2及HMC胞內(nèi)脂質(zhì)積聚顯著增加。并誘導(dǎo)HK-2發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)HMC增殖，胞外基質(zhì)表達(dá)增加。同時(shí)，胞內(nèi)LDLr，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(sterolregulatory element binding protein-2，SREBP-2)及SREBP裂解激活蛋白(SREBPcleavage-activating protein, SCAP)表達(dá)升高，激光共聚焦顯微鏡證實(shí)，AngⅡ能夠刺激胞內(nèi)SCAP/SREBP-2

8、從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的共轉(zhuǎn)位，進(jìn)而上調(diào)LDLr基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增加膽固醇攝入。
　　 結(jié)論:脂代謝紊亂可誘導(dǎo)腎固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化和腎系膜胞外基質(zhì)分泌，該過(guò)程可能與腎臟局部RAS激活有關(guān)，其中mTOR信號(hào)通路可能在調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)中發(fā)揮了重要作用。另一方面，AngⅡ可通過(guò)破壞LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)增加腎臟固有細(xì)胞內(nèi)膽固醇攝入，促進(jìn)脂質(zhì)沉積，進(jìn)而介導(dǎo)腎小球、腎小管細(xì)胞損傷。本研究闡明了腎臟局部RAS激活與脂代謝