GPR137對胰腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移性影響及其調(diào)控機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行闡述：
　　第一部分 GPR137與胰腺癌的臨床相關性研究
　　研究目的：
　　通過對胰腺癌臨床相關性研究，分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達情況
　　研究方法：
　　(1)免疫組織化學法比較了41例胰腺癌組織和癌旁胰腺組織，GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺組織組織中的表達情況區(qū)別
　　結(jié)果：
　　(1) GPR137在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中

2、的表達情況。20例呈陽性表達，1例呈弱陽性表達或無陽性表達。GPR137在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁胰腺組織。
　　結(jié)論：
　　本部分免疫組化實驗結(jié)果表明了GPR137在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁胰腺組織，實驗結(jié)果雖然跟患者的年齡，性別，分期等沒有什么顯著性的差異，這可能由于樣本量少的原因。根據(jù)本實驗結(jié)果中胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達水平均出現(xiàn)上調(diào)，可以推斷GPR137在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。
　　第二部分

3、 GPR137-RNAi慢病毒表達載體構(gòu)建和包裝
　　研究目的：
　　GPR137-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建和包裝，沉默胰腺痛細胞中GPR137基因的表達，為接下來的GPR137在胰腺癌細胞中的研究奠定實驗基礎。
　　研究方法：
　　(1)根據(jù)GenBank提供的GPR137的mRNA靶基因序列，設計并合成4對GPR137特異的siRNA。
　　(2)4組GPR137慢病毒敲減和過表達載體的構(gòu)建，并分別測序

4、檢測。
　　(3)慢病毒包裝實驗，并通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和滴度檢測。
　　結(jié)果：
　　(1)根據(jù)設計原則，成功設計并合成了4對針對GPR137基因的siRNA。
　　(2)成功地構(gòu)建了4組GPR137慢病毒敲減和過表達地載體。
　　(3) GPR137-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染48小時后，在熒光顯微鏡下觀察，可見被病毒感染的細胞呈綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率大于90％，證明轉(zhuǎn)染成功。隨后滴度測定顯示細胞感染效率接近1

5、00％。
　　結(jié)論：
　　本實驗根據(jù)網(wǎng)上在線設計siRNA的軟件，遵循RNAi設計原則，最終以慢病毒為載體構(gòu)建了4條針對GPR137基因的干擾片段，并通過熒光檢測其轉(zhuǎn)染效率大于90％，滴度檢測為為1.0E+07 TU/ml，成功構(gòu)建了針對目的基因GPR137的慢病毒載體，為下一步GPR137基因的研究提供了實驗基礎。
　　第三部分 GPR137在胰腺癌細胞中的功能表型研究
　　研究目的：
　　通過各種功能檢

6、測實驗，檢測敲除GPR137后胰腺癌細胞功能表型的變化，確定GPR137與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要性。
　　研究方法：
　　(1)慢病毒感染實驗，熒光觀察GPR137-RNAi慢病毒載體的感染效率。
　　(2)運用qRT-PCR方法檢測GPR137-RNAi慢病毒載體在mRNA層面上對GPR137基因的敲減效率。
　　(3)運用MTT細胞增殖實驗檢測了敲除GPR137后胰腺癌細胞增殖情況的變化。
　　(4)運用

7、克隆形成實驗檢測了敲除GPR137后胰腺癌細胞克隆形成能力的變化。
　　(5)運用流式細胞儀方法檢測了敲除GPR137后胰腺癌細胞周期的變化情況。
　　(6)運用AnnexinⅤ和7-AAD對聯(lián)合染色檢測Lv-shGPR137對細胞凋亡情況的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)用構(gòu)建好的慢病毒表達載體Lv-shCon和Lv-shGPR137去感染兩株人胰腺癌細胞BXPC-3及PANC-1，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在BXP

8、C-3中，慢病毒表達載體Lv-shCon和Lv-shGPR137的感染效率很高，達到90％以上;在PANC-1中，所構(gòu)建的慢病毒表達載體依然有很高的感染效率，約為80％左右。
　　(2) BXPC-3和PANC-1細胞在感染Lv-shGPR13748h后提RNA進行qRT-PCR檢測，GPR137敲減組比對照組的mRNA水平均降低了將近80％。
　　(3)在BXPC-3、PANC-1中進行MTT細胞增殖實驗，Lv-shGPR

9、137幾乎完全抑制了胰腺癌細胞的生長。
　　(4)BXPC-3細胞感染Lv-shGPR137后稀釋成單個細胞進行培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)Lv-shGPR137可以明顯抑制BXPC-3細胞的克隆形成能力。
　　(5)用BXPC-3細胞進行細胞周期實驗，BXPC-3細胞的細胞周期發(fā)生了明顯的變化，其處于G0/G1的細胞下降到細胞總數(shù)的50％左右，而處在S期的細胞數(shù)量則明顯上升，達到了35％，三組細胞處于G2/M期的細胞數(shù)量差異不大。

10、>　　(6) BXPC-3細胞在感染了Lv-shGPR137后，其活細胞數(shù)量明顯減少，約占總數(shù)的8％，處于早期凋亡的的細胞數(shù)量上升不明顯，大約為細胞總數(shù)的17％，而晚期凋亡的細胞數(shù)量則急劇增多，接近70％。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了GPR137-RNAi的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細胞中，通過沉默胰腺癌細胞中的GPR137基因的表達，探究GPR137缺失前后胰腺癌細胞功能表型的變化，結(jié)果表明GPR137在胰腺癌細胞中能明顯抑

11、制細胞的增殖和遷移，促進細胞的凋亡。
　　第四部分 GPR137在胰腺癌細胞中的分子機制研究
　　研究目的：對可能調(diào)控胰腺癌細胞的增殖抑制及促凋亡的分子機制和關鍵的蛋白的研究。
　　研究方法：
　　運用Western Blot技術檢測抑制GPR137對胰腺癌細胞凋亡相關蛋白的表達情況改變
　　結(jié)果：
　　在敲除GPR137的胰腺癌細胞中，PARP蛋白發(fā)生了活化，Caspase-3蛋白發(fā)生了上調(diào)，提示P

12、ARP和Caspase-3在抑制GPR137誘導胰腺癌細胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。
　　結(jié)論：
　　在胰腺癌細胞中，抑制GPR137的表達后，PARP發(fā)生了明顯的裂解激活現(xiàn)象，而Caspase-3的表達也明顯增強，說明了胰腺癌細胞發(fā)生了明顯凋亡，并且可能是由于PARP的裂解激活和Caspase-3的上調(diào)所導致的。本實驗對GPR137基因在胰腺癌中抑制細胞增殖和遷移、促進細胞凋亡的分子機制做了初步的探討，為尋找胰腺癌新的診斷標