復(fù)合組織移植中淋巴細(xì)胞克隆間的相互抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、目的及背景：
　　 燒傷、創(chuàng)傷和腫瘤等造成大范圍的肢體組織缺損很難通過傳統(tǒng)的自體組織移植獲得良好的形態(tài)學(xué)與功能學(xué)重建。利用異基因皮膚、肌肉、骨骼、神經(jīng)、肌腱、血管等不同發(fā)育來源的多種組織構(gòu)成的復(fù)合移植物，即異基因復(fù)合組織移植(Composite Tissue Allotransplantation，CTA)來替代缺損的肢體可能成為解決這一難題的有效手段之一。盡管目前臨床已成功進(jìn)行了多例CTA移植，但醫(yī)學(xué)界對于權(quán)衡長期應(yīng)用免疫抑制

2、劑造成的感染、腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)以及復(fù)合組織移植帶來的益處上尚存在爭議。如何誘導(dǎo)機(jī)體對于CTA的特異性免疫耐受可能成為推動(dòng)CTA臨床應(yīng)用的重要問題。但目前醫(yī)學(xué)界對于機(jī)體對CTA免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)以及其機(jī)制的認(rèn)識尚不完全。因此，深入探討CTA的免疫機(jī)理，可能為誘導(dǎo)CTA的長期特異性免疫耐受提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 從動(dòng)物模型的研究及臨床病例觀察中發(fā)現(xiàn)，CTA引起的免疫排斥反應(yīng)往往低于單一組織或器官移植，但這種低免疫應(yīng)答強(qiáng)度的原因尚

3、不清楚。其中，免疫細(xì)胞的抗原競爭(antigen competition)可能是CTA低免疫原性的機(jī)制之一。
　　 抗原競爭理論最早源于移植實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的一種次要組織相容性(mH)抗原刺激可抑制機(jī)體對另一種mH抗原的免疫反應(yīng)的現(xiàn)象。之后，在對模式抗原以及病毒抗原肽免疫反應(yīng)的研究中已經(jīng)證實(shí)，不同克隆的淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原識別過程中可通過競爭性結(jié)合抗原、向APC及其他淋巴細(xì)胞遞呈抑制性信號、分泌免疫抑制性細(xì)胞因子的方式抑制其它克隆

4、淋巴細(xì)胞的活化。然而，這一現(xiàn)象僅在一些識別相同抗原的TCR轉(zhuǎn)基因的T細(xì)胞克隆的模型中具有顯著效應(yīng)，而針對不同抗原的T細(xì)胞間的相互抑制作用則少有報(bào)道。
　　 CTA移植物由于其具有多種組織抗原的特點(diǎn)使其成為研究淋巴細(xì)胞克隆間相互作用的良好模型。CTA的低免疫原性也提示在其免疫反應(yīng)中存在針對不同組織抗原的淋巴細(xì)胞克隆間相互抑制的可能性。然而淋巴細(xì)胞的競爭性抑制在CTA移植免疫耐受中的作用亦主要源于現(xiàn)象的推測，而缺乏直接的證據(jù)支持。多

5、種組織抗原刺激是否能夠抑制淋巴細(xì)胞對異基因移植物的免疫排斥反應(yīng)，延長移植物的存活時(shí)間亦未見報(bào)道。
　　 因此，我們在本研究中設(shè)計(jì)了“差異化”的多種組織抗原刺激的CTA移植模型，以及多種MHC抗原刺激的體外與在體模型，以探討在異基因移植，特別是CTA移植的免疫反應(yīng)中淋巴細(xì)胞克隆間相互抑制作用及其可能機(jī)制。從而為進(jìn)一步了解CTA的免疫機(jī)理，誘導(dǎo)CTA的免疫耐受提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.將BN大鼠來源

6、的含不同組織成分的的“差異化”CTA移植物移植至F344大鼠，構(gòu)建CTA模型。分組為：S組(腹股溝皮片)，SL組(腹股溝皮瓣)，SLM組(腹股溝肌皮瓣)。觀察不同組織成分移植物的存活時(shí)間。
　　 2.在CTA術(shù)后第7天，于受體大鼠內(nèi)眥靜脈取血后，分離外周血淋巴細(xì)胞，與供體來源的淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，利用WST-8比色法檢測淋巴細(xì)胞增殖率。
　　 3.分離BalB/c(H-2d)、C3H(H-2k)、C57BL/6

7、(H-2b)Qa-1 WT及C57BL/6(H-2b)Qa-1 KO三種不同MHC表型的近交系小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。分別以單一MHC表型的淋巴細(xì)胞，或1:1混合的兩種MHC表型的淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，在體外進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。利用WST-8比色法檢測淋巴細(xì)胞增殖率。
　　 4.收集混合培養(yǎng)第72小時(shí)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，用ELISA法檢測細(xì)胞因子TGF-β1、TNF-α與IL-10的分泌。
　　 5.收集混合培養(yǎng)第7

8、2小時(shí)的淋巴細(xì)胞，提取總RNA，利用RT-qPCR檢測其IL-10、Foxp3基因的mRNA的表達(dá)水平。
　　 6.將單一BalB/c(H-2d)來源、單一C3H(H-2k)來源或同時(shí)將BalB/c與C3H來源的全層皮片移植至C57BL/6(H.2b)Qa-1 WT及C57BL/6(H-2b)Qa-1KO小鼠，觀察皮片存活時(shí)間及皮片基底部淋巴細(xì)胞浸潤情況。
　　 7.免疫組織化學(xué)染色檢測：Foxp3+細(xì)胞在各組皮膚移植物

9、基底部的分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同組織成分CTA的存活時(shí)間分別為：S組6.25±0.25天，SL組為9±0.707天，SLM組為10.5±0.6415天，SL及SLM組移植物存活時(shí)間較S組存活時(shí)間顯著延長(p=0.031，p=0.006)，而SLM組存活時(shí)間較SL組有延長趨勢，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.136)。
　　 2.不同組織成分CTA受體對供體來源淋巴細(xì)胞的增殖率分別為：S組1.632±0

10、.103，SL組1.588±0.294，SLM組1.508±0.232，組間無顯著差異。
　　 3.兩種刺激細(xì)胞以1:1混合后同時(shí)刺激引起的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)弱于相同數(shù)量的單一刺激細(xì)胞引起的細(xì)胞增殖。
　　 4.兩種MHC抗原刺激組的IL-10濃度顯著高于單一MHC抗原刺激組(p<0.001)。而TNF-α、TGF-β1濃度在各MLR反應(yīng)組間無顯著差異。
　　 5.兩種MHC抗原刺激組淋巴細(xì)胞IL-10 mRNA

11、表達(dá)顯著高于單一MHC抗原刺激組(p<0.001)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞標(biāo)志Foxp3基因表達(dá)在各反應(yīng)組及無抗原刺激的對照組間無顯著差異。
　　 6.兩種MHC抗原的皮膚同時(shí)移植組皮片存活時(shí)間及皮下淋巴細(xì)胞浸潤情況與單一MHC抗原組無顯著差異。皮下浸潤的炎性細(xì)胞中Foxp3+細(xì)胞比率在各組中無顯著差異。
　　 7.Qa-1基因敲除(KO)組中，多抗原刺激的MLR反應(yīng)中的淋巴細(xì)胞增殖率較單一抗原刺激組無顯著差異。Qa-1 KO受

12、體中，單一H-2d及H2-k表型抗原的皮膚移植物存活時(shí)間較WT組均顯著縮短(p=0.041，0.032)，但兩種MHC抗原的皮膚同時(shí)移植的排斥時(shí)間較WT組均無顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了組織成分“差異化”的CTA移植動(dòng)物模型。隨著CTA移植物組織成分復(fù)雜性的增加，CTA存活時(shí)間有延長的趨勢。但該作用并是不由受體的淋巴細(xì)胞對供體來源淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)的抑制所引起。在多種MHC抗原表型的皮膚移植模型中，兩種