HCV核心區(qū)多肽對細胞毒T細胞抑制作用的研究.pdf

1、近年來,國內(nèi)外有許多關(guān)于HCV轉(zhuǎn)梁、感染細胞模型的報道,但所建立的細胞模型與自然感染狀態(tài)的人肝細胞存在較大差別.我們用丙型肝炎病人血清中存在的HCV體外感染正常成人肝細胞,以期建立與自然感染狀態(tài)最為接近、更適宜于進行免疫發(fā)病機制和防治等研究的細胞模型.此外,CTL是執(zhí)行細胞免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞,在清除病毒感染和阻止感染慢性化中起關(guān)鍵作用,但在漫性HCV感染中CTL常常不能發(fā)揮其功效,影響因素可能是多方面的,核心區(qū)多肽對CTL有抑制作用

2、,可能是其功能缺陷的重要原因之一,我們篩選合成了部分HCV核心區(qū)多肽,免疫BALA/c小鼠,觀察這些多肽對小鼠CTL的影響.以下為主要研究結(jié)果和結(jié)論.1.用HCV核心區(qū)多肽皮下注射免疫BALB/c小鼠后,大多數(shù)小鼠健康反應(yīng)良好,取出小鼠脾臟后,注射CPA<,10>、CPB<,1>、CPB<,2>、CPB<,6>組脾臟肉眼觀察較正常陰性組增大,余脾臟與正常陰牲組大小相似.2.除CPA<,1>組因部分結(jié)果效靶比過高超出檢測范圍,余CTL檢測

3、計算結(jié)果經(jīng)方差分析,同次實驗陰性及正常對照組CTL活性無顯著性差異,HCV核心區(qū)多肽CPA<,9>(39~74位氨基酸)、CPB<,7>(67~76位氨基酸)、CPB<,8>(71-80位氨基酸)對BALB/c小鼠CTL有抑制作用,CPA<,10>(5~23位氨基酸)、CPB<,6>(63~72位氨基酸)、CPB<,2>(131~140位氨基酸)對小鼠CTL有增強作用.3.用HCV核心區(qū)抑制性多肽CPB<,7>、CPB<,8>和增強性多

4、肽CPB<,2>、CPB<,6>交叉組合后共同免疫BALB/c小鼠,其CTL活性經(jīng)單因素方差分析,正常和空白對照無顯著性差異,CPB<,2>+CPB<,7>、CPB<,6>+CPB<,7>組與正常、空白對照組無明顯差異,CPB<,2>+CPB<,8>組、CPB<,6>+CPB<,8>組中效靶細胞比為10:1,20:1的CTL活性顯著高于對照組,雙因素方差分析顯示HCV核心區(qū)抑制性多肽和增強性多肽有交互作用,抑制性多肽中CPB<,7>對增

5、強性多肽的影響更為明顯.4.用體外二步灌流法分離正常成人肝細胞,分離后細胞用臺盼藍染色,肝細胞存活率約90﹪,24h后約70~80﹪細胞貼壁,分離肝細胞在體外可存活一月余.5.用免疫組化法檢測加入HCV感染血清后的正常成人肝細胞內(nèi)HCVNS3、NS5抗原表達,可見自感染血清加入4日起,有呈棕色的陽性細胞出現(xiàn),主要抗原表達在胞漿,陽性細胞無明顯形態(tài)改變.陰性對照及空白對照無表達HCV NS3、NS5抗原的陽性細胞.6.用RT-PCR法檢測