青藤堿對紅斑狼瘡患者外周血T細胞的抑制作用及機制探討.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是自身免疫介導的，以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結締組織病，以多種自身抗體的產生和多系統(tǒng)損害為特征。本病病程以病情緩解和急性發(fā)作交替為特點。SLE在美國患病率約為14.6-50.8/10萬人，在我國為0.1％。女比男為7～9:1，SLE可發(fā)生于任何年齡，發(fā)病高峰為15～45歲。臨床表現(xiàn)廣泛[1]。 SLE的發(fā)病機理很復雜，可能是遺傳、性激素、環(huán)境等多因

2、素聯(lián)合介導的。免疫病理以T細胞、B細胞、單核細胞等共同參與的免疫異常為特征。某些情況下，由于T細胞功能失調，使B細胞具有高反應性，產生針對自身細胞核抗原物質的自身抗體。抗原抗體結合形成免疫復合物沉積在靶器官的血管壁上，造成細胞損傷。在B細胞分化和激活中，過度和失控的T細胞輔助可能起著重要的作用。 青藤堿(sinomenine，SIN)商品名正清風痛寧，是從中藥防己科植物青風藤根莖中分離提取的一種單體生物堿。它具有抗炎、免疫抑制、

3、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等作用。是治療風濕性疾病的有效藥物。近年來SIN已用于治療類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，成為治療多種自身免疫性疾病的常規(guī)用藥。目前，對SIN的免疫抑制作用進行了廣泛的研究。體外研究表明，SIN通過抑制人淋巴細胞IL-2R的表達，從而抑制IL-2對T細胞的作用。來實現(xiàn)其免疫抑制功能。在腎移植抗排斥治療的動物實驗研究中表明SIN可能通過抑制外周血CD4+細胞增殖，下調腫瘤壞死因子α(TN

4、F-α)、γ干擾素(IFN-γ)、白介素1(IL-1)，及上調IL-10的表達水平從而產生免疫抑制作用。體內外實驗均表明青藤堿可抑制一氧化氮(NO)自由基水平，抑制炎癥相關因子IL-1、IL-2、IL-6及TSNF-α。 除可作用于T細胞外，SIN對人體免疫系統(tǒng)中其他的細胞亞群，如樹突狀細胞、NK細胞和B細胞亞群也有作用。SIN可降低樹突狀細胞的抗原呈遞和協(xié)同刺激分子信號的表達，從而抑制APC對T細胞的協(xié)同刺激作用。此外SIN還

5、可抑制樹突狀細胞核內NF-kB的活性，導致樹突狀細胞的分化成熟障礙以及IL-12表達減低，進而抑制T細胞的活化，減少細胞因子TNF-α，II-2，IL-4，IFN-γ的表達。 自身免疫性疾病的免疫學機制包括由細胞免疫所介導的免疫應答，抗原提呈細胞產生IL-12，可誘導Th1細胞的分化，產生細胞因子IFN—γ和TNF-α，促進細胞免疫功能。體內外的研究證明，當IL-12和/或IFN—γ被抑制、基因被敲除或基因突變后，細胞免疫下降，

6、某些自身免疫性疾病得以控制，移植物的存活時間延長。 SIN免疫抑制機制尚未完全闡明。本課題通過研究青藤堿對正常人及SLE病人淋巴細胞功能和活化的作用，探討青藤堿的免疫抑制作用的可能機制，為臨床應用青藤堿提供理論和實驗依據(jù)。 目的： 探討SIN對正常人及系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人外周血T細胞γ-干擾素(interferon—gamma，IFN-γ)產生的抑制作用及其作用機制。 方法： 12例系統(tǒng)性紅狼瘡患者

7、的新鮮外周血，來自廣東省人民醫(yī)院風濕科就診的初診的SLE病人，每份10-20ML。病例均符合1997年美國風濕病協(xié)會修訂的SLE診斷標準，患者年齡15-49歲，平均年齡27.2歲，病程10天-7年，平均2.6年。SLEDAI評分：平均11.5分。正常人由20—40歲健康人捐獻，來自中山大學職工和學生； (1)密度梯度離心法分離正常人和SLE病人PBMCs，anti-CD3(0.2μg/mL)共培養(yǎng)細胞，再加入不同濃度SIN，用E

8、LISA方法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ產生的量，觀察SIN對IFN-γ產生的影響。 (2)在正常人PBMCs或SLE病人PBMCs加入anti-CD3共培養(yǎng)細胞，不加或加入SIN，使用流式細胞儀，在單個細胞水平上評價SIN對T淋巴細胞表面活化分子CD25、CD69的表達及細胞內細胞因子IFN-γ和IL-2產生的影響。 結果： (1)正常人PBMCs在未經(jīng)任何刺激的情況下不產生或產生極少量IFN-γ，當anti-CD

9、3刺激后產生大量的IFN-γ。在anti-CD3刺激的同時加入不同濃度的SIN，SIN能夠抑制anti-CD3誘導的正常人PBMCsIFN-γ產生，且這一效應呈劑量依賴性。 (2)正常人PBMCs經(jīng)anti-CD3或anti—CD3和1mMSIN培養(yǎng)6h，流式細胞術分析，SIN抑制正常人CD4+T細胞IFN-γ和IL-2的產生及CD8+T細胞IFN—γ的產生。 (3)細胞內細胞因子染色的結果表明，SIN不僅抑制CD4+和

10、CD8+T細胞IFN-γ產生細胞的百分率，同時還抑制IFN-γ的表達密度。SIN抑制CD4+IL-2產生細胞的百分率。 (4)anti-CD3刺激PBMCs3d后，CD4+T細胞(67.9％)和CD8+T(36％)細胞均表達CD25，SIN抑制CD4+(16.4％)和CD8+(2.57％)T淋巴細胞CD25分子的表達百分率。 (5)anti—CD3刺激PBMCs3d后，CD4+T細胞(82.1％)和CD8+T(69.6％

11、)細胞均表達CD69，SIN抑制CD4+(57％)和CD8+(37.6％)T淋巴細胞CD69分子的表達百分率。 (6)SLE病人PBMCs經(jīng)anti-CD3或anti—CD3和1mMSIN培養(yǎng)3d，anti—CD3主要誘導CD4+T細胞分泌IL-4，而CD8+T細胞極少產生IL-4。SIN抑制SLE病人CD4+T細胞IL-4的表達。 (7)SLE病人PBMCs經(jīng)anti—CD3或anti—CD3和1mMSIN培養(yǎng)3d，S

12、IN抑制SLE病人CD4+T細胞IFN-γ和IL-2的產生及CD8+T細胞IFN-γ的產生。 (8)anti—CD3刺激PBMCs3d后，SIN降低SLE病人CD4+和CD8+T淋巴細胞CD69表達百分比和平均熒光強度。SIN明顯抑制SLE病人CD25表達百分比和平均熒光強度。 結論： 本研究證明SIN能夠以劑量依賴方式抑制正常人PBMCsIFN-γ的產生，流式結果分析顯示SIN能夠抑制SLE病人CD4+T細胞產