外周血淋巴細胞HLA-A mRNA檢測在腎移植早期排斥反應(yīng)中的作用探討.pdf

1、目的： 1．建立檢測外周血淋巴細胞(PBL)人類主要組織相容性抗原-A(HLA-A)mRNA的一步法熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)的方法，初步應(yīng)用于腎移植患者移植前后外周血淋巴細胞HLA-AmRNA表達的檢測。探討淋巴細胞HLA-A mRNA的表達與機體免疫狀態(tài)及移植后早期急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 2．通過對HLA-AmRNA、CD4/CD8比值、血肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)、淋巴細胞數(shù)各項指標的比較

2、，探討淋巴細胞HLA-AmRNA作為早期急性排異反應(yīng)評估指標的價值。 方法： 依據(jù)GenBank中人HLA-AmRNA序列，根據(jù)HLA-A基因外顯子4、5中的保守序列自主設(shè)計、篩選引物及探針；以管家基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose6-phosphate dehydrogenasem，G6PDH)作為內(nèi)參照，設(shè)計引物及探針。運用Taqman探針技術(shù)，熒光定量RT-PCR擴增HLA-A mRNA和G6PDH m

3、RNA。檢測35例隨訪的腎移植患者的術(shù)前及術(shù)后半年內(nèi)不同時間的標本的閾循環(huán)數(shù)(Ct)和60例正常對照的閾循環(huán)數(shù)(Ct)，采用REST軟件分析其外周血淋巴細胞表面HLA-A mRNA的相對表達量。測定值大于等于正常值或者在連續(xù)監(jiān)測過程中表達較前顯著增強的腎移植患者，考慮有早期急性排斥反應(yīng)發(fā)生。以流式細胞術(shù)連續(xù)檢測CD4/CD8比值，ELISA檢測免疫抑制劑藥物濃度，評估機體的免疫狀態(tài)。血生化儀測定血肌酐、尿素氮。 結(jié)果：

4、 1．健康正常對照人群外周血淋巴細胞HLA-A mRNA的相對表達量是(1.14±0.32)。將此值設(shè)為目前外周血淋巴細胞HLA-AmRNA檢測的臨界值。 2．移植前外周血淋巴細胞HLA-A mRNA的相對表達量(1.03±0.56)與正常對照比較無差異(P>0.05)。 3．術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑，腎功能穩(wěn)定組一月內(nèi)外周血淋巴細胞HLA-AmRNA的相對表達量與正常對照組相比均降低(P<0.05)。 4．

5、術(shù)后急性排斥反應(yīng)組排斥反應(yīng)期外周血淋巴細胞HLA-A mRNA的相對表達升高(P<0.05)。與腎功能穩(wěn)定組同一時間相比，5例排斥反應(yīng)患者術(shù)后一月內(nèi)不同時間外周血淋巴細胞HLA-A mRNA表達在排斥反應(yīng)發(fā)生時顯著升高(P<0.05)。 5．HLA-A mRNA作為監(jiān)測早期急性排斥反應(yīng)的指標的敏感性是80％，特異性是90.3％，陽性預(yù)測率是66.7％，陰性預(yù)測率是96.5％。結(jié)合血肌酐檢測，可提高其檢測的敏感性和特異性。

6、 6．移植術(shù)前后連續(xù)監(jiān)測外周血T淋巴細胞亞群CD4/CD8比值，排斥反應(yīng)發(fā)生時較正常對照組明顯升高(P<0.05)，比值均>1.5。血藥濃度監(jiān)測，口服藥物吸收不規(guī)則，存在很大的個體差異。HLA-A單項診斷排斥反應(yīng)時變化更明顯，性能優(yōu)于其他指標。 結(jié)論： 1．成功建立了簡便快速、特異、重復(fù)性好、可信度高的檢測外周血淋巴細胞HLA-A mRNA基因表達的FQ-RT-PCR方法。結(jié)合REStT軟件，采用比較Ct值

7、的分析方法對淋巴細胞HLA-AmRNA進行相對定量。 2．外周血淋巴細胞HLA-AmRNA作為一個評估機體免疫狀態(tài)和預(yù)測早期排斥反應(yīng)發(fā)生的指標具有無創(chuàng)性，敏感性80％，特異性90.3％，陽性預(yù)測率66.7％，陰性預(yù)測率96.5％的特點。結(jié)合臨床血肌酐指標，可以進一步提高HLA-A mRNA檢測的敏感性和特異性，使外周血淋巴細胞HLA-A mRNA檢測具有良好的預(yù)測早期排斥反應(yīng)的前景。 3．HLA-A mRNA、血