基于生物信息學(xué)的小細(xì)胞食管癌基因表達(dá)譜及拷貝數(shù)變異研究.pdf

1、目的:小細(xì)胞食管癌是一種高度惡性的食管原發(fā)腫瘤，由于其較為罕見，至今無(wú)法設(shè)計(jì)前瞻性臨床研究，亦無(wú)治療指南?；谛〖?xì)胞食管癌與小細(xì)胞肺癌在生物學(xué)行為、病理組織形態(tài)、某些免疫組化指標(biāo)方面一定程度的相似性，目前臨床上參考小細(xì)胞肺癌對(duì)小細(xì)胞食管癌進(jìn)行分期和治療，但尚無(wú)分子生物學(xué)依據(jù)。即便是借鑒了小細(xì)胞肺癌的治療模式，小細(xì)胞食管癌初治后極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，二線治療療效差，遠(yuǎn)期生存率未顯著提高，總體療效仍不理想。目前小細(xì)胞食管癌分子遺傳學(xué)的研究幾為空白，

2、而參考小細(xì)胞肺癌治療模式所獲療效是否已達(dá)最優(yōu)尚不得而知，因此迫切需要深入了解其分子特征從而篩選有效的治療靶點(diǎn)。本研究將借助人類全基因組芯片平臺(tái)首次從基因表達(dá)譜和拷貝數(shù)變異的角度對(duì)小細(xì)胞食管癌及與其可能較為相關(guān)的腫瘤-小細(xì)胞肺癌、食管腺癌/鱗癌進(jìn)行分析、比較，了解可能為潛在治療靶標(biāo)的腫瘤相關(guān)基因，以期為小細(xì)胞食管癌后續(xù)的基礎(chǔ)和療效研究提供依據(jù)或提示研究方向。
　　方法:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫(kù)近期收集的三對(duì)小細(xì)胞食管癌及癌旁新鮮冰

3、凍組織標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行RNA及DNA抽提、純化、質(zhì)檢后，采用Affymetrix HumanU133 Plus2.0 Array對(duì)小細(xì)胞食管癌轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，并從NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選同芯片平臺(tái)、近3年的小細(xì)胞食管癌、食管腺癌、食管鱗癌及相應(yīng)正常組織(GSE30219、GSE26886)的原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，與小細(xì)胞食管癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。上述腫瘤與相應(yīng)癌旁或正常組織分別歸一化后，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False

4、Discovery Rate，F(xiàn)DR)＜0.01且倍數(shù)差異(Fold Change，F(xiàn)C)≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)。DEGs分別使用DAVID6.7及GSEA2.0.13進(jìn)行注釋，使用STRING9.0進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。小細(xì)胞食管癌的基因拷貝數(shù)變異(copy numbervariations，CNVs)研究利用基于芯片的比較基因組雜交技術(shù)(array-based C

5、omparativeGenomic Hybridization，aCGH)，芯片平臺(tái)為Agilent Human aCGH4x180k Array。使用CytoGenomics2.7.8.0軟件進(jìn)行質(zhì)控及CNVs篩選，2對(duì)及以上樣本出現(xiàn)的CNVs定義為高頻且研究范圍僅限于常染色體。將至少1例小細(xì)胞食管癌的CNVs所涉及基因與表達(dá)譜研究中以FDR＜0.01且FC≥2標(biāo)準(zhǔn)篩選所得的DEGs采用Refseq Transcript ID進(jìn)行CN

6、V和表達(dá)譜的關(guān)聯(lián)，共同的基因使用DAVID6.7進(jìn)行注釋。為進(jìn)一步研究CNV對(duì)基因mRNA表達(dá)的影響，本研究借鑒文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行小細(xì)胞食管癌aCGH數(shù)據(jù)與表達(dá)譜數(shù)據(jù)的整合分析，計(jì)算高頻區(qū)段基因的拷貝數(shù)相關(guān)基因表達(dá)倍數(shù)變化CNV-FC，使用SPSS19.0計(jì)算Log2(基因拷貝信號(hào))和Log2FC的Pearson相關(guān)系數(shù)r及相應(yīng)p值，CNV-FC≥2且r≥0.6(p＜0.05)的基因視為可能有意義的靶基因。最后，參考已發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行小細(xì)胞食

7、管癌與小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌的CNVs及涉及基因的比較。
　　結(jié)果:3對(duì)小細(xì)胞食管癌及相應(yīng)癌旁組織提取RNA及DNA滿足質(zhì)控要求，基因表達(dá)譜及aCGH芯片實(shí)驗(yàn)質(zhì)量良好。表達(dá)譜研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，小細(xì)胞食管癌篩選得1485個(gè)DEGs，神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)基因及增殖指標(biāo)高表達(dá);WNT相關(guān)基因簇上調(diào)、PTEN、RB、NOTCH相關(guān)基因簇下調(diào);DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、有絲分裂、DNA修復(fù)、端粒維持等生物過(guò)程及P53等通路存在DEGs的顯著

8、富集。小細(xì)胞食管癌、小細(xì)胞肺癌、食管腺癌/鱗癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)的整合分析發(fā)現(xiàn)，較之食管腺癌/鱗癌，小細(xì)胞食管癌與小細(xì)胞肺癌擁有更多相同的DEGs(829 vs.450)，且相關(guān)系數(shù)更大(Pearson相關(guān)系數(shù):小細(xì)胞食管癌vs.小細(xì)胞肺癌為0.60，小細(xì)胞食管癌vs.食管鱗癌為0.51，小細(xì)胞食管癌vs.食管腺癌為0.45，食管腺癌vs.食管鱗癌為0.73）;小細(xì)胞食管癌在主成分分析(Principal Component Analysis，

9、PCA)的二維空間上與小細(xì)胞肺癌更加接近。對(duì)上述腫瘤的DEGs分別注釋后發(fā)現(xiàn)，較之食管腺癌/鱗癌，小細(xì)胞食管癌與小細(xì)胞肺癌具有更多相同的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路，顯著富集于細(xì)胞周期、有絲分裂、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、端粒酶維持、P53通路;食管腺癌與食管鱗癌這兩種常見的食管腫瘤則生物學(xué)過(guò)程及通路高度相似，體現(xiàn)在ECM受體相互作用、軸突引導(dǎo)、整合素信號(hào)通路、組織發(fā)育、凋亡調(diào)控等方面。此外，小細(xì)胞食管癌與小細(xì)胞肺癌有更多共同上調(diào)的DEGs(58

10、4vs.155)，而與食管腺癌/鱗癌有稍多的共同下調(diào)DEGs(295 vs.245)，且這些共同上調(diào)基因的注釋結(jié)果與小細(xì)胞食管癌、小細(xì)胞肺癌所有DEGs分別注釋后再取交集所得的注釋結(jié)果高度一致。進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)分析顯示，小細(xì)胞食管癌與小細(xì)胞肺癌在轉(zhuǎn)錄層面形成的生物網(wǎng)絡(luò)非常相似，均以基因NUF2為中心，相同的網(wǎng)絡(luò)骨架基因有CENPF、NEK2、KIF11、TMPO、FOXM1;小細(xì)胞食管癌的網(wǎng)絡(luò)骨架基因主要參與細(xì)胞周期、有絲分裂、細(xì)胞周期檢驗(yàn)

11、點(diǎn)、紡錘體組裝、微管結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。3對(duì)小細(xì)胞食管癌及相應(yīng)癌旁組織經(jīng)CNVs分析得到高頻區(qū)段13個(gè)，其中14q11.2在3例小細(xì)胞食管癌樣本中均擴(kuò)增，4q22.3-23在3例樣本中均缺失。2例樣本存在的擴(kuò)增區(qū)段涉及5條染色體，分別是3q25.31-q29、5p15.31-15.2、8q21.11-24.3、9p23-13.1、14q11.2-32.33;2例樣本存在的缺失區(qū)段涉及3條染色體，分別是3p26.3-25.

12、3、4p16.3-11、4q11-22.3、4q23-25、8p23.3、16p13.3。結(jié)合小細(xì)胞食管癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，找到CNV與mRNA表達(dá)同步變化的基因306個(gè)，擴(kuò)增且上調(diào)基因194個(gè)，缺失且下調(diào)基因112個(gè)，這306個(gè)基因的注釋結(jié)果與單純表達(dá)譜所得DEGs的注釋結(jié)果具有較好的一致性，顯著富集于DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、有絲分裂、DNA修復(fù)等生物過(guò)程及P53、RB等通路。上述協(xié)同變化基因中包含表達(dá)譜研究中非常重要的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因NUF2

13、、CCNE2、NFIB、ETV5、KLF5、ATAD2、NDC80、ZWINT。本研究進(jìn)一步得到CNV-FC≥2且r≥0.6(p＜0.05)的基因39個(gè)，這些基因的表達(dá)能夠較好的區(qū)分小細(xì)胞食管癌與癌旁組織。上述39個(gè)基因的CNV-FC中位值為5.35(95％ CI:4.53-16.98)，PTP4A3基因的CNV-FC值最大，為21362.13，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.9983(p=0.037)。由于目前尚未找到與本研究采用相同aC

14、GH平臺(tái)的小細(xì)胞肺癌及食管腺癌/鱗癌數(shù)據(jù)，故在無(wú)法進(jìn)行芯片層面整合分析的前提下，我們收集既往文獻(xiàn)中小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌較公認(rèn)的、高頻的CNVs數(shù)據(jù)，與小細(xì)胞食管癌的aCGH數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果提示小細(xì)胞食管癌和小細(xì)胞肺癌結(jié)果提示小細(xì)胞食管癌和小細(xì)胞肺癌兩者間具有更多的潛在腫瘤相關(guān)基因且頻率較為接近，但是由歷史對(duì)照這所得的這一結(jié)論尚需更多數(shù)據(jù)的支持和論證。
　　結(jié)論:小細(xì)胞食管癌是一種遺傳特征較為獨(dú)特的食管惡性腫瘤，具有高度的復(fù)雜性和

15、異質(zhì)性。本研究涉及的aCGH數(shù)據(jù)與表達(dá)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，兩者具有較好的一致性。研究結(jié)果初步提示，和較為常見的食管腺癌/鱗癌相比，小細(xì)胞食管癌與小細(xì)胞肺癌可能在基因mRNA表達(dá)模式和CNV層面更加相似，有待系統(tǒng)、全面的研究數(shù)據(jù)支持。此外，細(xì)胞周期、有絲分裂、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)等生物過(guò)程及P53、RB等通路可能在小細(xì)胞食管癌中扮演重要角色，NUF2、PTP4A3等基因可能是參與小細(xì)胞食管癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的潛在腫瘤相關(guān)基因，需要后續(xù)驗(yàn)證性