人巨細(xì)胞病毒影響滋養(yǎng)細(xì)胞B7-H1表達(dá)水平的體外實驗研究.pdf

1、【目的】研究人巨細(xì)胞病毒（HCMV）對滋養(yǎng)細(xì)胞B7-H1表達(dá)水平的影響，MAPK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和microRNA 對此過程的調(diào)控作用，并初步探討小分子RNA 干擾技術(shù)干預(yù)效果。
　　 【方法】
　　 1、常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞（Human embryonic lungfibroblast,HEL）以及絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞系HPT-8。
　　 2、HCMVAD169 株體外細(xì)胞培養(yǎng)法傳毒增殖，R

2、eed-Muench 法計算病毒半數(shù)細(xì)胞感染量TCID50。
　　 3、熒光定量PCR檢測不同感染滴度HCMV對HPT-8表達(dá)B7-H1mRNA水平的影響。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測不同感染滴度HCMV 對HPT-8表達(dá)B7-H1 蛋白水平的影響。
　　 5、Western-blot 檢測HCMV 誘導(dǎo)HPT-8表達(dá)B7-H1 過程中的MAPK 磷酸化水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑特異性抑制劑對HCM

3、V 刺激HPT-8表達(dá)B7-H1 蛋白水平的影響。
　　 6、熒光定量PCR檢測不同感染滴度HCMV 對HPT-8 內(nèi)MiR-513表達(dá)水平的影響。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測HCMV 對轉(zhuǎn)染miR-513 特異性的Mimics和Inhibitor的HPT-8細(xì)胞 B7-H1 蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 7、設(shè)計B7-H1 特異性siRNA 質(zhì)粒,構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體，流式細(xì)胞術(shù)檢測HCMV對轉(zhuǎn)染B7-H1siRNA的

4、HPT-8細(xì)胞B7-H1 蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 【結(jié)果】
　　 1．HCMV AD169 毒株TCID50 為10-3.29/100ul。
　　 2．2TCID50～200TCID50 六個感染滴度的HCMV 均可刺激HPT-8表達(dá)B7-H1Mrna和蛋白。其中，100TCID50 水平HCMV的刺激作用最強(qiáng)（與空白對照比較，P<0.05）。
　　 3．HCMV 可以誘導(dǎo)HTP-8細(xì)胞中ERK1/2

5、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑磷酸化。低濃度DMSO、JNK抑制劑SB203580（20μM）和P38 抑制劑SP600125（10μM）均不影響HCMV 所致的HPT-8細(xì)胞表達(dá)B7-H1 蛋白水平（與空白對照組比較，P>0.05）；ERK1/2 抑制劑U0126（10μM）可抑制HCMV 上調(diào)HPT-8表達(dá)B7-H1的作用（與空白對照組比較，P<0.05）。
　　 4．HCMV 感染后，HPT-8細(xì)胞中miR-513表達(dá)明顯降低（P<0.0

6、5）；HPT-8 轉(zhuǎn)染miR-513-Inhibitor后B7-H1 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）； HPT-8 轉(zhuǎn)染miR-513-Mimics后，HCMV 刺激其表達(dá)B7-H1 蛋白的作用減弱（P<0.05）。
　　 5．B7-H1 siRNA-1、B7-H1 siRNA-2、B7-H1 siRNA-3 轉(zhuǎn)染后不同程度抑制HCMV 刺激HPT-8細(xì)胞表達(dá)B7-H1 蛋白的作用（P<0.05）。
　　 【結(jié)論】①H