b.thuringiensis穿梭載體的構(gòu)建及cry1c基因的表達(dá)

1、南開大學(xué)碩士學(xué)位論文B.thuringiensis穿梭載體的構(gòu)建及cry1C基因的表達(dá)姓名：何翔申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳啟民19990501Ab s t r a c tB a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u b s p . k e n y a e A g i s a k i n d o f n e w b i o p e s t i c i d

2、 e s , w h i c hh a s h i g h t o x i c i t y a g a i n s t H e l i o t h i s a r m i g e r a , b u t i t h a s c e r t a i n s h o r t c o m i n g s . F o re x a m p l e , i t s s p e c t r u m a g a i n

3、s t p e s t s i s n a r r o w a n d i t s f e r m e n t a t i v e t i t e r i s l o w e r . S o ,t h e r e i s n e c e s s a r i t y t o i m p r o v e i t s g e n e t i c p r o p e r t y . W e h o p e

4、 t o i n t r o d u c e t h ec r y 1 C g e n e i n t o B t k e n - A g , s o a s t o o b t a i n a n b r o a d s p e c t r u m i n s e c t i c i d a le n g i n e e r i n g s t r a i n .W e h a v e c l o

5、n e d a 1 . 7 - k b r e p l i c o n f r a g m e n t f r o m B t k e n - A g , t h e r e s t r i c t i o nm a p o f w h i c h i s d i f e r e n t f r o m t h e r e p l i c o n f r o m B . t h u r i n g

6、i e n s i s H D 7 3 . O n t h i sb a s i s , w e c o n s t r u c t e d a s h u t l e v e c t o r p H V - 1 , w h i c h u s e s p l a s m i d p U C 1 9 a sp a r e n t a l v e c t o r a n d a p h l g e n

7、e a s s e l e c t i v e m a r k e r . P l a s m i d p H V - 1 c a n b e i n h e r i t e ds t a b l y i n E . c o l i a f t e r 1 0 0 g e n e r a t i o n s , t h e m a i n t e n a n c e r a t e o f p l

8、a s m i d p H V - 1 i sa b o v e 8 0 % . H o w e v e r , t h e m a i n t e n a n c e r a t e o f i t i s o n l y 2 0 % o r s o i n及t h u r i n g i e n s i s s u b s p . i s r a e l e n s i s 4 Q 8 .I n

9、 t h i s r e s e a r c h , w e c l o n e d t h e p r o m o t e r o f t h e r m o s t a b l e a - a m y l a s e g e n ef r o m B . l i c h e n i f o r m i s a n d t h e c r y 1 C s t r u c t u r a l g e n

10、e f r o m B . t h u r i n g i e n s i s 9 5 1 0s t r a i n . T h e n w e i n s e r t e d b o t h o f t h e m i n t o t h e p l a s m i d p H V - 1 a n d p l a s m i dp H T 3 1 5 . T h e r e c o m b i n

11、a n t p l a s m i d s w e r e i n t r o d u c e d i n t o B . t h u r i n g i e n s i s s u b s p .i s r a e l e n s i s 4 Q 8 v i a e l e c t r o p o r a t i o n . T h e S D S - P A G E w a s u s e d t o

12、 d e t e r m i n e t h ee x p r e s s i o n o f c r y 1 C g e n e , a n d a 1 3 0 k D a p r o t e i n b a n d c a n b e o b s e r v e d i n t h e l a n eo f p H V - c r y 1 C a n d p H T - c r y 1 C .

13、 W e c a n a l s o o b s e r v e a b i p y r a m i d a l C r y 1 C p r o t e i n ,b u t i t s a c t i v i t y a g a i n s t S p o d o p t e r a e x i g u e h a s t o b e d e t e r m i n e d .R e s t r i

14、 c t i o n m a p a n d P C R a n a l y s i s o f c r y ] C g e n e s h o w t h a t t h e c l o n e d c r y l Cg e n e i s t h e s a m e a s t h e p u b l i s h e d c r y 1 C g e n e i n丑 t h u r i

15、n g i e n s i s s u b s p .e n t o m o c i d u s , b u t t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f p r o t e i n e x p r e s s e d i s s m a l l e r t h a n C r y 1 Cp r o t e i n .T h u s , r e s u l t s a

16、b o v e a l s o p r o v i d e s o m e i n f o r m a t i o n a n d b a s i s f o r t h e s t u d y o fg e n e t i c b a c k g r o u n d o f B . t h u r i n g i e n s i s 9 5 1 0K e y w o r d s : 丑 t h u r i