人sTRAIL原核分泌表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及活性研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病。目前治療惡性腫瘤主要采取手術(shù)、化療和放療三大傳統(tǒng)療法，雖然能清除大部分的腫瘤細(xì)胞，但仍有部分抗性細(xì)胞殘余導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，同時(shí)也對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生較大的毒副作用，因此對(duì)腫瘤的治療就成為當(dāng)今的一大難題，尋找更為有效的抗腫瘤藥物是目前的研究熱點(diǎn)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，簡(jiǎn)稱TRAIL）是人體內(nèi)正常表達(dá)的一種蛋白，是TNF超家族中的

2、一名新成員。TRAIL蛋白能特異性地與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而不能誘導(dǎo)正常組織和細(xì)胞凋亡?；谶@一優(yōu)點(diǎn)，有望成為新型有效的治療腫瘤藥物，是目前腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)。
　　人TRAIL分子，基因編碼281個(gè)氨基酸，從第95位或104位殘基開(kāi)始克隆可溶性分子TRAIL(sTRAIL)構(gòu)建重組表達(dá)載體，表達(dá)出的蛋白均有活性?；钚圆课晃挥诘?14-281位氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)的可溶性、無(wú)毒副作用及生物學(xué)活性兼具的長(zhǎng)度，因此

3、本文選取第114-281位氨基酸片段作為研究對(duì)象。
　　從HL-60（急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系）中提取總RNA，根據(jù)GeneBank提供的人TRAIL基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增人可溶性TRAIL基因114-281位氨基酸片段的特異性引物，同時(shí)引入限制性核酸內(nèi)切酶NcoI、BamHI和TEV蛋白酶的酶切位點(diǎn)及His標(biāo)簽的基因序列，并將目的基因克隆至表達(dá)載體PhoA，成功構(gòu)建分泌型重組表達(dá)載體phoA-sTRAIL，經(jīng)NcoI、BamHI酶切鑒

4、定和測(cè)序分析，在大腸桿菌MM294中誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)Ni柱純化，還原性SDS-PAGE和非還原性SDS-PAGE進(jìn)行分析。
　　結(jié)果表明本文所獲取的蛋白以二聚體的形式存在。經(jīng)western blot鑒定，在27KD處有一特異性條帶，正是目的蛋白sTRAIL。
　　分別以三種腫瘤細(xì)胞，即非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株HepG2和慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株K562，為試驗(yàn)細(xì)胞株進(jìn)行了sTRAIL蛋白的生物活性檢測(cè)，結(jié)果顯示s