細(xì)胞微泡內(nèi)的DNA組成與功能及其在動脈粥樣硬化中的作用研究.pdf

1、背景:
　　細(xì)胞間通訊可以確保組織內(nèi)不同細(xì)胞的功能相互協(xié)調(diào)。細(xì)胞間通訊包括可溶性因子、隧道納米管和細(xì)胞微泡等,它們都可以在不同細(xì)胞間水平傳遞細(xì)胞表面分子或細(xì)胞質(zhì)。微泡是一種大多數(shù)細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下都會分泌的圓形的質(zhì)膜片斷,包括外泌體和微?；蛎撀湫∨輀1,2]。目前,對微泡的生物學(xué)功能了解甚少,有研究認(rèn)為它主要參與細(xì)胞分泌、免疫調(diào)節(jié)、凝血、細(xì)胞間通訊等生理或病理過程[3-5]。
　　微泡是一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),其生成、豐度、大小

2、、內(nèi)含物和生物學(xué)功能等均存在異質(zhì)性。微泡內(nèi)含蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等多種生物大分子[6-9],表面還攜帶母體細(xì)胞來源的的抗原、脂質(zhì)等,這些均有利于其在循環(huán)中與受體細(xì)胞融合,水平運輸外源的蛋白質(zhì)和核酸[10-13],參與細(xì)胞間通訊并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)功能[8,9,14,15]。此外,有研究報道微泡介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊在動脈粥樣硬化的形成中扮演了重要角色[15]。
　　最近的研究發(fā)現(xiàn)微泡內(nèi)含線粒體DNA和染色體DNA[16,17]

3、。Waldenstrom等[17]進一步報道了在心肌細(xì)胞微泡內(nèi)存在的染色體DNA可以轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi),但這些轉(zhuǎn)移的微泡DNA是否具有功能并不清楚。本研究旨在全面分析微泡DNA的組成、深入探索其在細(xì)胞間通訊中的生物學(xué)功能和生理意義并進一步闡明其在動脈粥樣硬化形成中作用和具體機制。
　　方法:
　　1、根據(jù)之前的報道通過多步離心法分離人血漿或細(xì)胞上清液中的微泡,并應(yīng)用透射電鏡、免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)等多種方法進行鑒

4、定[8,9,15]。
　　2、通過熒光激活細(xì)胞分選器、微流控技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳、高通量Solexa測序和PCR等方法分析血漿和細(xì)胞上清液中微泡內(nèi)DNA的特征。
　　3、為進一步探索微泡DNA的轉(zhuǎn)移與功能,我們將過表達AT1受體的HEK293細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞分泌的微泡DNA轉(zhuǎn)移至未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中,通過PCR、免疫印跡等方法檢測受體細(xì)胞中AT1的mRNA和蛋白水平。為了揭示轉(zhuǎn)移的微泡DNA轉(zhuǎn)錄的機制,我們通過激光共聚

5、焦的方法觀察受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與微泡轉(zhuǎn)移的AT1DNA的作用關(guān)系。
　　4、平滑肌細(xì)胞與HEK293細(xì)胞的研究對于證實轉(zhuǎn)移的微泡DNA轉(zhuǎn)錄進而增加相應(yīng)mRNA表達水平僅提供了間接的證據(jù)。為克服這一局限,我們將K562細(xì)胞微泡中的BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)移至HEK293細(xì)胞中,優(yōu)勢在于HEK293細(xì)胞中并不存在BCR/ABL融合基因,通過PCR、免疫印跡等方法檢測受體細(xì)胞中BCR/ABL融合基因的mRNA和蛋白水平

6、。為深入探索微泡中BCR/ABL融合基因的生理意義,我們將其轉(zhuǎn)移至正常人外周血來源的中性粒細(xì)胞中,通過雙色熒光原位雜交技術(shù)檢測中性粒細(xì)胞中BCR/ABL融合基因的表型。
　　5、為深入探索微泡DNA在動脈粥樣硬化形成中的作用與機制,我們應(yīng)用高通量的Solexa技術(shù)對冠心病人群與非冠心病人群血漿微泡DNA基因拷貝數(shù)的差異表達進行了初篩,然后用定量PCR進行驗證。此外,我們應(yīng)用PCR和免疫印跡的方法對上述兩個人群中的白細(xì)胞內(nèi)的SRY基

7、因拷貝數(shù)、mRNA和蛋白水平也進行了比較。進一步地,我們觀察了兩個人群中白細(xì)胞粘附因子的表達差異。
　　結(jié)果:
　　1、透射電鏡顯示微泡呈現(xiàn)圓形雙層小泡結(jié)構(gòu),大小30-1000nm之間,與之前報道結(jié)果一致[8,9,15]。我們流式細(xì)胞術(shù)進一步檢測分析了大于200nm的微泡顆粒[18]。免疫印跡法也證實在微泡中存CD63、AGO2、TSG101、Flotillin-1和HSP70等標(biāo)志蛋白。
　　2、熒光激活細(xì)胞分選器、

8、微流控技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳和PCR等多種方法均檢測到在人血漿或平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離的微泡內(nèi)含DNA。這種DNA中包含雙鏈DNA,長度在1-20kb之間,大多數(shù)在17kb左右。高通量Solexa測序技術(shù)也發(fā)現(xiàn)人血漿微泡中至少存在16434種基因組DNA。
　　3、通過PCR測序方法證實從穩(wěn)定過表達AT1蛋白的HEK293細(xì)胞(AT1-HEK293細(xì)胞)培養(yǎng)上清液中分離的微泡中存在AT1-EGFPDNA,而平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中

9、分離的微泡中存在AT1DNA。將AT1-HEK293細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞微泡與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)后,免疫熒光研究提供了微泡DNA轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞核周及核內(nèi)的直接證據(jù)。而且,轉(zhuǎn)移的AT1DNA還可以與其轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合,啟動該DNA轉(zhuǎn)錄的同時增加AT1mRNA和蛋白表達。另外,這些新生成的AT1mRNA和蛋白可以顯著地被放線菌素D所抑制。
　　4、K562細(xì)胞微泡與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)后使受體細(xì)胞表達BCR/ABL融合基因的m

10、RNA和蛋白,而且這種外源性的表達可以被同時孵育的放線菌素D所阻斷。應(yīng)用雙色熒光原位雜交技術(shù)從基因組水平也檢測出20％的中性粒細(xì)胞在孵育了K562細(xì)胞微泡后表達BCR/ABL融合基因。
　　5、應(yīng)用高通量Solexa測序和定量PCR,我們發(fā)現(xiàn)冠心病患者血漿微泡中SRYDNA的基因拷貝數(shù)顯著高于非冠心病人群。同時,我們也檢測出冠心病患者外周血白細(xì)胞中SRY的基因拷貝數(shù)、mRNA和蛋白水平亦顯著高于正常者。更重要地是,這些白細(xì)胞中粘附

11、因子CD11a表達顯著增強,提示微泡在細(xì)胞間水平轉(zhuǎn)移SRY基因并可能通過上調(diào)SRY蛋白的表達而增強白細(xì)胞的粘附功能。
　　結(jié)論:
　　總之,母體細(xì)胞來源的微泡DNA可以傳遞至受體細(xì)胞并且增加受體細(xì)胞相應(yīng)基因編碼的mRNA和蛋白水平,進而影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能。此外,微泡轉(zhuǎn)移的SRY基因在動脈粥樣硬化形成中扮演了重要角色。微泡介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移提供了一種在細(xì)胞間基因傳遞的新方法和信號傳導(dǎo)的新途徑。這些發(fā)現(xiàn)將有助于探索疾病發(fā)生的