精索靜脈曲張對睪丸超微結(jié)構(gòu)和精子形態(tài)、功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:精索靜脈曲張是青壯年男性中的常見病及多發(fā)病,是由于精索靜脈血液回流受阻或靜脈瓣膜功能失效而導(dǎo)致精索靜脈迂曲擴(kuò)張所致。精索靜脈曲張好發(fā)于左側(cè),是由于左側(cè)精索靜脈是以直角注入左腎靜脈,而右側(cè)精索靜脈是以斜角注入下腔靜脈等解剖結(jié)構(gòu)原因造成的。WHO將精索靜脈曲張列為青壯年男性不育原因的第一位,可見精索靜脈曲張?jiān)谀行圆挥械闹匾匚?。目前研究表明精索靜脈曲張致男性不育涉及到免疫、內(nèi)分泌、細(xì)胞凋亡、血液反流、溫度變化及感染等多方面原因,但均

2、不能完全解釋其發(fā)病機(jī)制。本研究通過實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張動(dòng)物模型的建立,在透射電鏡下觀察睪丸生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)研究精子運(yùn)動(dòng)能力及形態(tài),來揭示精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的機(jī)理,為臨床精索靜脈曲張的研究和治療提供參考。
　　 方法:
　　 1動(dòng)物分組:選擇鼠齡(50±10)天(青春期),體重240～280g的SD(Sprayue-Dawley)三級雄性大鼠40只,將大鼠隨

3、機(jī)分為精索靜脈曲張組(實(shí)驗(yàn)組)20只,假手術(shù)組(對照組)20只,所有大鼠在同等條件下飼養(yǎng)12周,自由飲食、飲水。
　　 2模型的建立:精索靜脈曲張動(dòng)物模型按Turner法建立,用10％水合氯醛(3.33 ml/kg)腹腔注射麻醉,固定后取上腹正中切口,打開腹腔后,將左腎周圍的內(nèi)臟組織移到右側(cè),使左側(cè)腎臟及左腎靜脈完全暴露,在左腎至下腔靜脈間完全分離出左腎靜脈,于左腎上腺靜脈與下腔靜脈之間置-8號(hào)注射器的針頭(直徑約0.8mm),

4、在左腎靜脈與下腔靜脈交叉處用3-0的絲線將針頭與左腎靜脈一同結(jié)扎,這樣大約就能使左腎靜脈直徑縮小一半,然后抽出針頭,可見到左腎靜脈擴(kuò)張充血,用生理鹽水沖洗腹腔后4-0的絲線依次縫合切口;假手術(shù)組完全顯露出左腎靜脈后只穿線打結(jié),而不縮窄左腎靜脈,余步驟同手術(shù)組。術(shù)后連續(xù)三天腹腔注射青霉素(20萬單位1/日),術(shù)后第12周將兩組大鼠分別脫頸處死,如果手術(shù)組左側(cè)精索靜脈直徑大于1mm,并且左右兩側(cè)腎臟重量無明顯差別表示動(dòng)物模型建立成功。

5、>　　 3睪丸電鏡標(biāo)本的采集及觀察:手術(shù)摘取兩組動(dòng)物左側(cè)睪丸后,立即切取約1mm3大小睪丸組織放入含2％戊二醛和1％多聚甲醛混合液中,在混合液中固定24小時(shí)后,立即用pH值為7.4的PBS液漂洗12小時(shí),然后將標(biāo)本放入1％四氧化鋨酸液中再固定2小時(shí),再次用pH值為7.4的PBS液漂洗,隨后用梯度乙醇將標(biāo)本脫水,再用環(huán)氧樹脂將其包埋,制作成超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色后,以HITACHI-H7500型透射電鏡觀察睪丸的超微結(jié)構(gòu)。

6、
　　 4精液標(biāo)本的采集及檢測:脫頸處死大鼠后,立即摘取兩組動(dòng)物的附睪,并剔除掉附睪周圍的脂肪組織,用PBS液洗凈后,切下附睪的尾部,然后用眼科剪在其尾部切開三個(gè)縱行的裂口,立即放入2ml的離心管中,將PBS液加至2ml,然后將離心管放入37℃水浴箱中,讓精子自由游出,水浴20分鐘后將離心管取出。
　　 4.1用微量移液器吸取10μl上層的精液懸液,采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)能力的檢測。觀察參數(shù)為

7、:精子密度(p),精子活率(MOT),直線運(yùn)動(dòng)精子密度,直線運(yùn)動(dòng)精子活率,路徑速度(VAP),a級快速向前運(yùn)動(dòng),b級快速向前運(yùn)動(dòng),曲線速度(VCL),直線速度(VSL),鞭打頻率(BCF),平均移動(dòng)角度(MAD),線性度(LIN),前向性(STR),擺動(dòng)性(WOB),側(cè)擺幅值(ALH)。4.2用可調(diào)節(jié)加樣器吸取40μl精子懸液滴在載玻片上,然后用加樣吸頭側(cè)向輕輕將懸液推開,讓其自然晾干,用甲醇固定10min后,再自然晾干,然后將載玻片放

8、入含有1％伊紅染液的染色缸中染色,染色1.5小時(shí)后將載玻片取出并用自來水沖洗,自然晾干(每個(gè)精液標(biāo)本制片2張),最后,在光學(xué)顯微鏡下觀察精子的形態(tài),計(jì)算精子畸形率。
　　 所有數(shù)據(jù)用((x-)±s)表示,兩組間差異比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05或a=0.01。
　　 結(jié)果:
　　 1電鏡觀察的結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較,支持細(xì)胞基膜水腫,細(xì)胞間大部

9、分融合,Sertoli-Sertoli細(xì)胞連接模糊不清或者斷裂,胞質(zhì)內(nèi)線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量明顯減少,可見大量的溶酶體顆粒;間質(zhì)細(xì)胞表面的微絨毛,胞質(zhì)內(nèi)的線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量均明顯較少,胞質(zhì)內(nèi)可見大量的溶酶體顆粒,較大的空泡,凋亡細(xì)胞增加,染色質(zhì)固縮:精子細(xì)胞核畸形,核內(nèi)可見大量的空泡、核膜消失,頂體消失或?yàn)樾№旙w,染色質(zhì)過度濃縮。
　　 2精液分析的結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較,精子活率(MOT)、前向性(STR)的值降低,

10、兩組之間存在顯著性差異(P＜0.05);精子密度(p)、直線運(yùn)動(dòng)精子密度、直線運(yùn)動(dòng)精子活率、路徑速度(VAP)、a級快速前向運(yùn)動(dòng)、b級快速前向運(yùn)動(dòng)、曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、側(cè)擺幅度(ALH)值明顯降低,而畸形率顯著增加,兩組之間比較具有顯著性(P＜0.01);精子平均移動(dòng)角度(MAD)、線性度(LIN)、擺動(dòng)性(WPB)、鞭打頻率(BCF)的值無明顯變化,兩組之間比較無差異性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論: