膿毒癥時(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)膜依賴的TGF-β1促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:Treg(CD4+CD25+T細(xì)胞)為機(jī)體內(nèi)重要負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，膿毒癥時(shí)Treg功能增強(qiáng)，可能與脾臟內(nèi)效應(yīng)性T細(xì)胞的大量凋亡有關(guān)，在膿毒癥免疫紊亂發(fā)生中具有重要作用。資料表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的分化、增殖和凋亡中具有直接作用，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)膿毒癥小鼠脾臟Treg功能狀態(tài)以及體外共培養(yǎng)時(shí)對(duì)Teff(CD4+CD25-T細(xì)胞)凋亡的影響，分析TGF-β1在介導(dǎo)Treg促進(jìn)Teff凋亡中的作用及相關(guān)

2、分子機(jī)制，為膿毒癥的免疫調(diào)理治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶標(biāo)。
　　 方法:建立穩(wěn)定的小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型，分別于術(shù)后24小時(shí)(h)、48h斷頸處死小鼠，無(wú)菌留取脾臟，免疫磁珠法分選CD4+CD25-T細(xì)胞(Teff)與Treg。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg表面TGF-β1、CTLA-4及胞內(nèi)Foxp3的表達(dá)水平;RT-PCR法檢測(cè)Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β1 mRNA水平。另外，用抗-CD3抗體(5μg/ml)和抗-CD28抗

3、體(5μg/ml)預(yù)孵育96孔培養(yǎng)板1h后，將CFSE標(biāo)記的-Teff與Treg按照2∶1的比例進(jìn)行混合培養(yǎng)(細(xì)胞濃度為1×106/ml):1.采用CCK-8和AnnexinV-PE法檢測(cè)共培養(yǎng)68h后Teff的增殖和凋亡，分析膿毒癥時(shí)Treg的功能變化，及其對(duì)Teff增殖和凋亡的影響;2.培養(yǎng)液中加入抗TGF-β抗體，應(yīng)用CCK-8和Annexin V-PE法檢測(cè)共培養(yǎng)68h后Teff的增殖和凋亡，并采用Western blot法檢測(cè)

4、共培養(yǎng)后Teff細(xì)胞內(nèi)Smad2/P-Smad2及Smad3/P-Smad3的蛋白水平，分析TGF-β1在膿毒癥時(shí)Treg誘導(dǎo)Teff凋亡中的作用;3.細(xì)胞經(jīng)DIOC6(3)染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后Teff線粒體膜電位的變化，然后采用Western blot技術(shù)檢測(cè)Teff細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bim的變化，并用化學(xué)比色法分析caspase-3，8，9的相對(duì)活性。分析膿毒癥時(shí)Treg通過(guò)膜表面TGF-β1促進(jìn)Teff凋亡的

5、機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.膿毒癥時(shí)Treg表型的變化及對(duì)Teff增殖和凋亡的影響:(1)建立了穩(wěn)定的CLP模型，術(shù)后Sham組（假傷組）小鼠無(wú)死亡，72h存活率為100％。CLP組術(shù)后72h存活率為50％，且均具有膿毒癥的表現(xiàn)。(2)與sham組相比，CLP-24h組、CLP-48h組Treg表面的TGF-β1、CTLA-4及胞內(nèi)的Foxp3表達(dá)均明顯增強(qiáng)。(3)與兩CLP組Treg共培養(yǎng)使得Teff的增殖率與凋亡

6、率明顯升高。
　　 2.TGF-β1是膿毒癥中Treg促進(jìn)Teff凋亡機(jī)制的重要信號(hào)分子:(1)與sham組相比，CLP-24h組、CLP-48h組Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β1基因水平均升高。(2)在Treg∶Teff共培養(yǎng)體系中加入抗TGF-β抗體(25μg/ml)后，使得Teff的增殖抑制率與凋亡率均降低。(3)相對(duì)于sham組Treg，與CLP-24h組、CLP-48h組Treg共培養(yǎng)使得培養(yǎng)上清中促炎因子(IL-2、IFN

7、-γ)分泌降低，而抑炎因子(TGF-β1、IL-4、IL-10)升高。(4) Smad2、Smad3蛋白表達(dá)量在各組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;相對(duì)于sham組，與CLP-24h組、CLP-48h組Treg共培養(yǎng)促進(jìn)Teff內(nèi)P-Smad2、P-Smad3蛋白表達(dá)量增加;與未加抗TGF-β抗體比較，加入抗體之后P-Smad2、P-Smad3蛋白表達(dá)量降低。
　　 3.共培養(yǎng)后Teff細(xì)胞線粒體膜電位、Bcl-2及Bim蛋白表達(dá)量、cas

8、pase-3，8，9的相對(duì)活性的變化:(1)相對(duì)于sham組Treg，與CLP-24h組、CLP-48h組Treg共培養(yǎng)使得Teff線粒體膜電位均降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量下降、Bim蛋白表達(dá)量升高，caspase-3，8，9的相對(duì)活性均升高。(2)與相應(yīng)組別未加TGF-β抗體的培養(yǎng)條件相比，Teff∶Treg共培養(yǎng)體系中加入TGF-β抗體之后，使得Teff的線粒體膜電位升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高、Bim蛋白表達(dá)量降低，caspas