HMGB1-PTEN信號對膿毒癥肺損傷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及機(jī)制.pdf

1、評論：
　　本研究的必要性：
　　膿毒癥系嚴(yán)重感染引起的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征（SIRS）,可導(dǎo)致多器官功能障礙或衰竭。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)對炎性反應(yīng)具有重要的負(fù)反饋調(diào)控作用，可減輕肺損傷。盡管針對Treg已開展了大量的研究，但是膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷過程中HMGB1-PTEN信號對Treg活化的調(diào)控機(jī)制目前國內(nèi)外尚無報道。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及重要意義：
　　我們率先提出并初步驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞上 HMGB1-PTE

2、N軸在肺的炎性反應(yīng)過程中對調(diào)控Treg具有重要作用HMGB1-PTEN是調(diào)控Treg水平的一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，針對這一機(jī)制開展的初步探討可能為ARDS的防治提供了一條潛在的治療途徑。
　　背景：
　　膿毒癥由嚴(yán)重感染引起,是ICU患者高死亡率的主要原因。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）系臨床膿毒癥患者中的常見并發(fā)癥，同時也是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡率增高的重

3、要原因。盡管藥物研究取得很大的進(jìn)展，但療效甚微，這也提示膿毒癥誘導(dǎo)炎性反應(yīng)中的分子機(jī)制的復(fù)雜性，尚有很多未知亟需進(jìn)行深入探討。脂多糖（LPS）刺激巨噬細(xì)胞,經(jīng) TNF-α或IL-1β介導(dǎo)導(dǎo)致高遷移率族 B1(HMGB1)的大量釋放，而利用特異性的抗體阻斷HMGB1可明顯減輕LPS引起的損傷。最新的研究顯示，HMGB1在觸發(fā)先天及特異性免疫反應(yīng)中扮演重要角色，被認(rèn)為是一種警示信號（alarmin），
　　最近有報道Treg對免疫介導(dǎo)

4、的炎性反應(yīng)具有重要作用，對LPS引起的肺損傷具有保護(hù)作用。動物研究證明PTEN活性的增強(qiáng)可以減少 CD4+CD25+Tregs的產(chǎn)生且導(dǎo)致生存率下降，T細(xì)胞上的PTEN基因缺陷可以促進(jìn)IL-2受體介導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs增加,因此PTEN可能是維持Treg穩(wěn)態(tài)的一種重要的調(diào)節(jié)子。PTEN的缺乏可引起細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的積聚，而敲除PTEN基因可增強(qiáng)P13K的表達(dá)，并減輕了由細(xì)菌感染引起的巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)和急性肺損傷的

5、程度。因此，β-catenin/PDK1/Akt信號通路可能在炎性反應(yīng)過程中具有調(diào)控Treg產(chǎn)生的重要作用。盡管這方面已進(jìn)行了相關(guān)的研究，但是位于巨噬細(xì)胞（先天免疫反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞）上的HMGB1-PTEN信號軸在膿毒癥（sepsis）引起的急性肺損傷過程中，對Treg的分化是否具有調(diào)控作用以及具體分子機(jī)制的研究，目前國內(nèi)外尚無報道，HMGB1在膿毒癥性肺損傷過程中究竟如何介導(dǎo)了免疫反應(yīng)的分子機(jī)制也仍未明確。因此亟需進(jìn)行研究。

6、>　　目的：
　　探討HMGB1-PTEN信號對CD4+CD25+FOXP3+Treg的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，有望為ARDS的機(jī)制研究提供新線索，進(jìn)而為ARDS的防治提供一條新途徑。
　　方法：
　　本項(xiàng)目擬臨床觀察結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)時RT-PCR、凝膠電泳遷移率（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、Western Blot、基因沉默等分子生物學(xué)技術(shù)，從不同層次探討A

7、LI中HMGB1對CD4+CD25+Tregs分化及免疫狀態(tài)的影響及其作用的關(guān)鍵受體和可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具體分為以下幾個部分：
　　(1)HMGB1對膿毒癥引起的ARDS患者Treg水平的影響:分別檢測膿毒癥引起的ARDS患者及健康體檢人群的外周血中HMGB1濃度及CD4+CD25+CD127low的水平，進(jìn)行二者之間的相關(guān)性分析。
　　(2)建立LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的的小鼠模型：采用野生型及特定髓系PTEN基因敲除的小鼠

8、，分別腹腔注射LPS及重組HMGB1（rHMGB1）誘導(dǎo)小鼠的肺損傷模型，觀察并評價肺損傷程度
　　(3)進(jìn)一步檢測HMGB1、TGF-β、TNF-α、IL-17A、IL-23(p-19)及Treg的水平，分析 HMGB1對TGF-β、TNF-α、 IL-17A、IL-23分泌的影響。
　?。?）分別檢測巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞上的HMGB1、PTEN、β-catenin、PDK1和Akt的蛋白表達(dá)，分析HMGB1對 PTEN活

9、性、Tregs分化的影響，探討HMGB1/PTEN信號在HMGB1誘導(dǎo)小鼠肺損傷中的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
　?。?）觀察PTENM-KO對 HMGB1介導(dǎo)ALI的保護(hù)作用。
　?。?）利用巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)技術(shù)，采用阻斷巨噬細(xì)胞HMGB1-PTEN信號的方法破壞HMGB1-PTEN軸，觀察阻斷HMGB1對TGF-β、Tregs和β-catenin/PDK1/Akt的影響。
　?。?） PTENM-KO對TGF-β、Tre

10、gs和β-catenin/PDK1/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，確定HMGB1-PTEN信號的調(diào)節(jié)作用并分析其作用的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。?）與健康對照組相比，膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS患者血漿中HMGB1的水平明顯升高，而Treg水平明顯下降，且二者之間呈負(fù)相關(guān)。（2）通過阻斷HMGB1或在髓系上特異性敲除了PTEN基因進(jìn)行干預(yù)，明顯減低了LPS或rHMGB1誘發(fā)的肺損傷的程度，同時TGF-β的水平明顯增加，促進(jìn)了β-

11、catenin/PDK1/Akt信號傳導(dǎo)，以及Treg水平的提高。（3）體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：阻斷HMGB1-PTEN信號導(dǎo)致CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明顯增高。
　　結(jié)論：
　　臨床研究顯示：在膿毒癥引起的ARDS患者中，外周血HMGB1的升高與Treg水平的下降呈明顯相關(guān)性。在對LPS或rHMGB1處理后的小鼠體內(nèi)外的研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：HMGB1可以觸發(fā)髓系上的PTEN介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。髓系