激活的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過CD39依賴機(jī)制保護(hù)心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:激活的Treg細(xì)胞減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷
　　目的:炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）具有免疫調(diào)節(jié)作用并參與多種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展，然而Treg細(xì)胞在MIRI中的作用未見報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)的目的是探究Treg細(xì)胞對(duì)小鼠MIRI的影響。
　　方法:通過阻斷冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘恢復(fù)再灌注建立小鼠MIRI模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)再灌注后不同

2、時(shí)間點(diǎn)（5分鐘，6小時(shí)，24小時(shí)）心臟及脾臟中Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)。免疫磁珠聯(lián)合流式分選Foxp3-GFP knockin C57BL/6小鼠脾臟的CD4+GFP+Treg細(xì)胞，經(jīng)過體外anti-CD3/CD28抗體和IL-2刺激3天激活或直接用于過繼轉(zhuǎn)輸；于手術(shù)前72小時(shí)腹腔注射小鼠anti-CD25單抗部分去除或使用DEREG小鼠選擇性去除體內(nèi)Treg細(xì)胞。再灌注后1天檢測(cè)增加或去除Treg細(xì)胞后MIRI相關(guān)指標(biāo)，包括血清肌鈣蛋白及E

3、van’s blue和TTC雙染檢測(cè)梗死區(qū)和危險(xiǎn)區(qū)面積；超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（EF）和左室短軸縮短率（FS）以評(píng)價(jià)心功能。體外激活Treg細(xì)胞與新鮮分離的Treg細(xì)胞比較IL-10、TGF-β1mRNA水平，腺苷產(chǎn)生能力及CCR5的表達(dá)增高。此外，建立MIRI模型，過繼轉(zhuǎn)輸激活或新鮮分離的Treg細(xì)胞，于再灌注后6小時(shí)處死小鼠，免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠心臟Treg細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)果:心肌組織中Treg細(xì)胞比例在再灌注5分鐘便

4、呈增高趨勢(shì)，但與假手術(shù)組（Sham）相比，各時(shí)間點(diǎn)Treg細(xì)胞比例的增高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而再灌注后5分鐘心肌組織中的Treg細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目升高，之后持續(xù)上升，再灌注6小時(shí)到達(dá)高峰，24小時(shí)下降，但仍高于Sham組。與野生型小鼠（wild type）相比，DEREG組小鼠MIRI后心肌梗死面積增大，心功能進(jìn)一步惡化，表現(xiàn)為梗死部分/危險(xiǎn)區(qū)域（I/AAR）和肌鈣蛋白增高，EF和FS均下降。而抗CD25單抗組與同型對(duì)照組相比，心肌梗死面積及心功

5、能無明顯改變。此外，與介質(zhì)組（Vehicle）相比，外源性給予激活的Treg細(xì)胞組小鼠MIRI后梗死面積減小，心功能改善，而外源性給予新鮮分離的Treg細(xì)胞組小鼠心肌梗死面積及心功能均無明顯改變。經(jīng)體外激活的Treg細(xì)胞較新鮮分離的Treg細(xì)胞表達(dá)更多IL-10、TGF-β1及CCR5，并產(chǎn)生更多的腺苷。免疫熒光及流式分析結(jié)果提示MIRI后激活的Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)地浸潤(rùn)至心肌局部的能力。
　　結(jié)論:Treg細(xì)胞在小鼠再灌注后心肌

6、組織中浸潤(rùn)增多。Anti-CD25單抗部分去除Treg細(xì)胞或過繼轉(zhuǎn)輸新鮮分離的Treg細(xì)胞對(duì)MIRI沒有影響。而使用DEREG小鼠選擇性完全去除小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞加重MIRI，給予體外激活的Treg細(xì)胞則減輕MIRI，說明激活的Treg細(xì)胞在MIRI中發(fā)揮保護(hù)作用。此外，激活的Treg細(xì)胞較新鮮分離的Treg細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制功能及遷移浸潤(rùn)能力。
　　第二部分:Treg細(xì)胞通過CD39在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用
　　

7、目的:Treg細(xì)胞主要通過分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β1）及細(xì)胞接觸機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，Treg細(xì)胞表面的CD39和CD73分子可以完成ATP到腺苷的整套催化過程，而腺苷也被認(rèn)為是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的一個(gè)重要介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察Treg細(xì)胞保護(hù)小鼠MIRI的效應(yīng)分子。
　　方法:將C57BL/6背景的IL-10-/-小鼠與Foxp3-GFP knockin小鼠雜交得到IL-10-/-Foxp3-

8、GFP knockin小鼠。按上述Treg細(xì)胞分離培養(yǎng)方法得到體外激活的IL-10-/-Treg，CD39-/-Treg和WT Treg細(xì)胞用于過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)。于再灌注前5分鐘分別靜脈注射anti-TGFβ1抗體加WT Treg細(xì)胞，IL-10-/-Treg或CD39-/-Treg細(xì)胞，再灌注后24小時(shí)檢測(cè)上述MIRI相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果:與WT Treg細(xì)胞相比，靜脈注射anti-TGFβ1抗體加WT Treg細(xì)胞或IL-10-/

9、-Treg細(xì)胞有相同的保護(hù)MIRI作用，表現(xiàn)為梗死面積下降及心功能改善；然而CD39-/-Treg細(xì)胞對(duì)MIRI無保護(hù)作用。
　　結(jié)論:小鼠MIRI中，體外激活的Treg細(xì)胞通過表面分子CD39而不是IL-10和TGF-β1發(fā)揮心臟保護(hù)作用。
　　第三部分:Treg細(xì)胞通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕MIRI
　　目的:心肌細(xì)胞凋亡及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在小鼠MIRI進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是探究在MIRI中

10、，Treg細(xì)胞對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的凋亡以及中性粒的細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，并研究其作用機(jī)制。
　　方法:隨機(jī)將C57BL/6小鼠分為四組：假手術(shù)組（Sham，只穿線不結(jié)扎），Treg細(xì)胞組（給予體外激活的WT小鼠Treg細(xì)胞，Treg），CD39-/-Treg細(xì)胞組（給予體外激活的CD39-/-Foxp3-GFP knockin小鼠Treg細(xì)胞，CD39-/-Treg），對(duì)照組（給予PBS，Control）。再灌注后3h檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞凋亡（

11、TUNEL染色法），分析心肌caspase-3活性（分光光度法），髓過氧化物酶（MPO）活性和流式細(xì)胞術(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞心肌組織局部的浸潤(rùn)情況，實(shí)時(shí)PCR和免疫印跡檢測(cè)心肌局部趨化分子（LIX，KC和MIP-2）的表達(dá)。此外，C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組（Sham），MIRI組（按上述方法建立MIRI模型，MIRI）。分別于再灌注后30分鐘，1小時(shí)和3小時(shí)western blot檢測(cè)RISK信號(hào)通路的激活情況。分離乳鼠

12、原代心肌細(xì)胞，H2O2刺激后不同時(shí)間點(diǎn)（30分鐘，1小時(shí)，3小時(shí)）western blot檢測(cè)Akt和ERK1/2磷酸化水平；將乳鼠原代心肌細(xì)胞分別與體外激活的WT Treg細(xì)胞、CD39-/-Treg細(xì)胞或腺苷共培養(yǎng)48小時(shí)，再在培養(yǎng)體系中加入ATP并以H2O2刺激，30分鐘后western blot檢測(cè)Akt和ERK1/2的磷酸化，4小時(shí)后TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，24小時(shí)后ELISA檢測(cè)上清趨化分子KC和LIX的表達(dá)，tr

13、answell檢測(cè)中性粒細(xì)胞的趨化。
　　結(jié)果:在小鼠MIRI模型中，與介質(zhì)組(Vehicle)相比，WT Treg細(xì)胞組心肌凋亡減少，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目下降，心肌組織局部中性粒細(xì)胞趨化分子KC和LIX表達(dá)減少。然而過繼轉(zhuǎn)輸CD39-/-Treg細(xì)胞對(duì)心肌凋亡及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)沒有明顯影響。體外實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組（Control）相比，與WT Treg細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯減少H2O2引起的心肌細(xì)胞凋亡及趨化分子KC和LIX表達(dá)，減少中性粒

14、細(xì)胞的遷移。但缺乏CD39可部分阻斷Treg細(xì)胞的這一保護(hù)作用。此外培養(yǎng)體系中加入腺苷也發(fā)揮與WT Treg細(xì)胞相同效應(yīng)。再灌注后Akt和ERK1/2的磷酸化在心肌組織中明顯增高，于30分鐘達(dá)到高峰，3小時(shí)有所下降。與介質(zhì)組（Vehicle）相比，過繼轉(zhuǎn)輸WT Treg細(xì)胞可明顯增高小鼠再灌注后30分鐘心肌局部Akt和ERK1/2的磷酸化，而CD39-/-Treg細(xì)胞組則無明顯差異。乳鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)H2O2刺激后Akt和ERK1/2的

15、磷酸化明顯增高，并于30分鐘到達(dá)高峰，3小時(shí)有所下降。與對(duì)照組（Control）相比，心肌細(xì)胞與WT Treg細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯增加Akt和ERK1/2的磷酸化，但缺乏CD39可阻斷Treg細(xì)胞的這一作用，此外預(yù)先將腺苷加入培養(yǎng)體系也可以增加心肌細(xì)胞中Akt和ERK1/2的磷酸化。
　　結(jié)論:活化的Treg細(xì)胞通過CD39抑制心肌細(xì)胞凋亡，激活促生存的信號(hào)通路Akt和ERK1/2，并減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)而保護(hù)MIRI。
　　第四

16、部分:急性心肌梗死患者急診PCI術(shù)后外周血中Treg細(xì)胞比例下降，但CD39表達(dá)增高
　　目的:通過證實(shí)Treg細(xì)胞在小鼠MIRI模型中的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察急性ST段抬高型心肌梗死患者再灌注后體內(nèi)Treg細(xì)胞的改變。
　　方法:收集15例進(jìn)行急診PCI治療的急性ST段抬高型心肌梗死患者，分別于不同時(shí)間點(diǎn)（血管再通前，球囊擴(kuò)張時(shí)，植入支架后1小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)和72小時(shí)）采血。另收集15例年齡性別相匹配

17、的冠脈造影證實(shí)冠脈正常的健康對(duì)照并采血。流式檢測(cè)患者與健康對(duì)照外周血中Treg細(xì)胞的比例及其表面分子CD39的表達(dá)。
　　結(jié)果:與健康對(duì)照組相比，STEMI患者血管再通前外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例無明顯差異。但與血管再通前相比，患者在球囊擴(kuò)張及支架植入后外周Treg細(xì)胞比例開始下降，支架植入1小時(shí)后下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，6小時(shí)最低，72小時(shí)后仍呈下降狀態(tài)。CD39+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在患者血管再通后并沒有明顯