PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)U937細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制探討.pdf_第1頁(yè)
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1、過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferators-activatedreceptor,PPAR)是一類(lèi)由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,屬于核激素受體超家族成員。有3種亞型PPARα、PPARβ、PPARγ。所有亞型可以和9-順式維甲酸受體RXR(9-Cis-retinoic acid reccptor RXR)形成二聚體,參與調(diào)節(jié)代謝途徑,產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng),如參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、糖代謝、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化及腫瘤細(xì)胞

2、的分化與凋亡。大量資料顯示,PPARγ在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),可以誘導(dǎo)細(xì)胞多種腫瘤細(xì)胞凋亡,但是其機(jī)制并不十分清楚,同時(shí)研究表明PPARγ激動(dòng)劑可以通過(guò)PPARγ依賴和PPARγ非依賴兩種方式發(fā)揮生物學(xué)作用。
   近年來(lái),炎癥介質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。許多炎癥介質(zhì)可以為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供良好環(huán)境,如巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)可以抑制P53基因的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)P53蛋白的表達(dá)水平,從而使P53失去

3、抑癌功能,導(dǎo)致機(jī)體失去對(duì)細(xì)胞周期的控制以及DNA損傷的修復(fù)功能,進(jìn)而導(dǎo)致促腫瘤基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。有些炎癥介質(zhì)還具有促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散及浸潤(rùn)的功能,如CXC趨化因子家族可以促進(jìn)腫瘤組織中血管的增生,加速腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移。某些白細(xì)胞介素如IL-10能夠抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,還可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸功能。PPARγ在許多免疫及炎癥參與細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞中均有表達(dá)。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,抗

4、腫瘤藥物在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí),常常伴有多種炎癥介質(zhì)的釋放。由于炎癥介質(zhì)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲存在著密不可分的關(guān)系,作為具有明顯抗炎作用的PPARγ激動(dòng)劑,是否通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮抗腫瘤作用,目前尚未見(jiàn)資料報(bào)道。
   腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是重要的生物活性因子之一,它能夠調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞趨化作用,促進(jìn)粘附蛋白的表達(dá)以及通過(guò)誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growt

5、h factor,VEGF)的表達(dá)促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管的增生;此外,TNF-α還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平和生物活性,從而破壞及降解細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等。Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)是天然免疫反應(yīng)中抵抗病原微生物入侵機(jī)體的第一道防線。至今已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中TLRs家族有13個(gè)成員,命名為T(mén)LR1-13。在人類(lèi)中有11個(gè)成員,它們分布十分廣泛,主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)

6、突狀細(xì)胞、多形核細(xì)胞、T、B細(xì)胞及NK細(xì)胞等表面,屬于模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptor,PRR),可對(duì)不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecularpatterns,PAMPs)進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合,并引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放。目前資料表明,腫瘤細(xì)胞表面TLRs的表達(dá)及活化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。TLRs誘導(dǎo)的腫瘤免疫逃避可能是與

7、促進(jìn)某些細(xì)胞因子的釋放和抑制某些炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。既往資料表明,用TLR4的配體LPS刺激腫瘤細(xì)胞時(shí),可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避NK細(xì)胞和CTL的攻擊,逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。目前的資料已經(jīng)證明PPARγ激動(dòng)劑對(duì)白血病U937細(xì)胞具有顯著的體外增殖抑制作用,但其機(jī)制是否與U937細(xì)胞表面TLR表達(dá)水平變化有關(guān),即羅格列酮是否通過(guò)影響TLR4表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗白血病作用尚不明確。
   研究目的:
   觀察PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(R

8、GZ)對(duì)U937細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,同時(shí)通過(guò)測(cè)定羅格列酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的抑制作用以及對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)釋放的抑制作用,從而探討PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(RGZ)通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)TNF-α及TLR4的釋放來(lái)抑制白血病細(xì)胞的增殖,為PPARγ信號(hào)通路的抗白血病作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   研究方法
   本研究采用人單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株為靶細(xì)胞,主要有以下幾種方法:
  

9、 1取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以不同濃度的RGZ(5、10、20、40、50、60、80、100μmol/L)及加入10umol/LGW9622作用于U937細(xì)胞24、48、72h后,采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。
   2用流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV/PI雙染色法觀察RGZ作用細(xì)胞24、48、72h后細(xì)胞凋亡率。
   3碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞儀分析藥物作用72小時(shí)后細(xì)胞周期的變化。
 

10、  4加入10ug/ml LPS刺激細(xì)胞24小時(shí)后,加入不同濃度的羅格列酮作用于細(xì)胞12、24、48小時(shí),RT-PCR法分析藥物作用前后PPARγ、TLR4mRNA表達(dá)變化,免疫酶化學(xué)法測(cè)定TLR4表達(dá)分布的變化,同時(shí)采用直接免疫熒光法流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR4在藥物作用前后表達(dá)量的變化。
   5采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定對(duì)照組及不同濃度RGZ作用于LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞后12、24、48h后上清液中TNF-α水平

11、的變化。
   6 SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,采用單因素方差分析,以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)U937細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與TNF-α及TLR4的表達(dá)水平做相關(guān)性分析。
   結(jié)果:
   1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下觀察:可見(jiàn)細(xì)胞圓形,透亮,呈葡萄串樣生長(zhǎng)。MTT結(jié)果顯示10μmol/L以上的RGZ對(duì)U937細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,當(dāng)RGZ濃度大于80μmol/L,產(chǎn)生明顯的抑制作

12、用,且呈明顯的時(shí)間依賴性和劑量依賴性,GW9662對(duì)RGZ的抑制作用無(wú)明顯影響。(p>0.05)。
   2 AnnexinV/PI雙染色法顯示:RGZ可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡,50μmol/L以上RGZ作用于U937細(xì)胞48h、72h可以明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,100μmol/L RGZ作用于細(xì)胞48h、72h凋亡率大于50%。
   3不同濃度RGZ作用于U937細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,60、80、100μmol/LRGZ作

13、用于U937細(xì)胞72h后,可見(jiàn)隨著藥物濃度的增加,G0/G1期細(xì)胞所占百分比明顯增加。S期細(xì)胞所占百分比明顯降低(p<0.05),即羅格列酮可以將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
   4加入10ug/ml LPS刺激細(xì)胞24小時(shí)后,細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),胞體變大,胞質(zhì)不透明,且形狀成多形性,少數(shù)出現(xiàn)偽足及突起。藥物作用前后PPARγ無(wú)明顯變化,而RGZ可以抑制TLR4mRNA及蛋白表達(dá),但是TLR4在細(xì)胞內(nèi)的定位未發(fā)生變化。
  

14、 5 ELISA結(jié)果顯示:對(duì)照組上清液中TNF-α表達(dá)較少,但是LPS誘導(dǎo)后TNF-α表達(dá)量明顯增加,5μM RGZ作用后TNF-α表達(dá)量進(jìn)一步增加,尤其在作用24h,此效應(yīng)最明顯,10μM以上的RGZ對(duì)TNF-α的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)明顯的量效及時(shí)效性。
   結(jié)論:
   1 PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可以抑制U937細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
   2不同濃度的羅格列酮

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