豬瘟病毒蛋白對其3’UTR的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、豬瘟（Classical swine fever）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引發(fā)的一種疾病，具有高致病性和高傳染性，可對豬類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疾病。
　　豬瘟病毒是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組包括一個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF)，一個(gè)3’端非編碼區(qū)（3’untranslated region，3’UT

2、R）和一個(gè)5’端非編碼區(qū)（5’ untranslated region，5’UTR)。豬瘟病毒的開放閱讀框編碼一個(gè)由3898個(gè)氨基酸所組成的多聚蛋白，該多聚蛋白可在病毒自身蛋白酶和宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶的水解和修飾作用下形成12個(gè)成熟的蛋白，包括C、Erns、E1、E2、Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。豬瘟病毒基因組的復(fù)制過程需要多種自身非結(jié)構(gòu)蛋白的參與，研究表明NS3、NS4A、NS4B、NS5A、N

3、S5B是豬瘟病毒RNA復(fù)制所必需的。豬瘟病毒3’UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括4或5個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop，SL)，對病毒RNA的復(fù)制和翻譯有著重要作用。
　　為了研究豬瘟病毒各個(gè)蛋白對其3’UTR在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用，本研究構(gòu)建了豬瘟病毒各蛋白的真核表達(dá)載體和3’UTR的熒光素酶表達(dá)載體，并將各蛋白的真核表達(dá)載體分別與3’UTR的熒光素酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析各蛋白對3’UTR的功能是否

4、具有調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示豬瘟病毒C、NS4A、NS5A和NS5B蛋白對其3’UTR的功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用。其中C蛋白和NS5B蛋白可以顯著降低3’UTR的翻譯抑制功能，因此推測C蛋白和NS5B蛋白對病毒的翻譯起到促進(jìn)作用；而NS4A、NS5A蛋白可以促進(jìn)3’UTR的翻譯抑制功能，推測對病毒的翻譯起到抑制作用。
　　為了進(jìn)一步研究豬瘟病毒C蛋白對其3’UTR在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用，首先研究C蛋白在3’UTR上的具體調(diào)節(jié)位點(diǎn)。通過構(gòu)建3

5、’UTR不同莖環(huán)區(qū)域調(diào)控下的熒光素酶表達(dá)載體，并與C蛋白的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)C蛋白對其3’UTR的調(diào)節(jié)位點(diǎn)主要定位于3’UTR的1-139nt區(qū)（SL-1和SL-2）。同時(shí)也研究了豬瘟病毒C蛋白對3’UTR發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要功能區(qū)域。利用生物信息學(xué)對C蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)59-69位氨基酸為C蛋白的氨基酸保守區(qū)，對該區(qū)域進(jìn)行缺失突變后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示豬瘟病毒C蛋白的59-69位氨基酸對于C蛋白在3’U