天然免疫分子TLR4在造血干細胞移植術(shù)后GVHD中的作用及其機制研究.pdf

1、造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是當(dāng)今治療惡性血液腫瘤的重要手段，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)等移植并發(fā)癥嚴(yán)重影響移植效果和臨床的廣泛應(yīng)用。本項目從臨床和動物實驗?zāi)Ｐ腿胧?，對造血干細胞移植供受者TLR4(Toll-like receptors，TLRs)基因單核苷酸多態(tài)性(single Nucleotide Pol

2、ymorphisms，SNP)與移植術(shù)后GVHD發(fā)病率和嚴(yán)重程度以及術(shù)后感染的關(guān)系進行了研究。同時也建立了TLR4基因缺陷的小鼠骨髓移植模型，以期研究TLR4分子表達對GVHD發(fā)病率和移植生存期的影響，觀察TLR4基因缺陷對DC(dendritic cells，DCs)成熟、抗原遞呈功能和誘導(dǎo)T細胞異基因免疫反應(yīng)能力的影響，闡明TLR4在GVHD中的分子機制。本研究將為惡性血液腫瘤移植術(shù)后GVHD的預(yù)后因素和防治的研究提供新的思路，為造

3、血干細胞移植治療惡性血液病提供新的理論依據(jù)，具有重要的研究意義。
　　 本研究通過小鼠移植模型探討了TLR4基因在骨髓移植后GVHD的發(fā)生中扮演的角色。GVHD的發(fā)生有3個因素，其中關(guān)鍵因素是供者淋巴細胞識別供者或受者的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)而活化，轉(zhuǎn)移到靶組織器官對受者的組織器官發(fā)生攻擊，引起組織破壞。樹突狀細胞作為一類具有最強抗原提呈功能的細胞群體，在識別和遞呈抗原啟動免疫應(yīng)答

4、、誘導(dǎo)移植排斥中起重要的作用。人們一直認(rèn)為，DC是抗原提呈能力最強的APC，是唯一能夠激活初始型T細胞的APC，具有激活移植排斥反應(yīng)的作用。利用小鼠同種異基因骨髓移植模型觀察TLR4基因缺陷小鼠DC誘導(dǎo)同種移植免疫耐受效果，并分析了相關(guān)的免疫機制。通過研究TLR4基因敲除小鼠DC在體內(nèi)外對供者T細胞成熟、分化和功能的影響以及致耐受作用的不同來了解TLR4在GVHD中所扮演的角色。BALB/c、C5781/6小鼠是純系的同種小鼠，這兩種小

5、鼠的主要和次要組織相容性抗原(MHC-Ⅰ、Ⅱ)均不相同，可進行同種間移植排斥反應(yīng)的免疫學(xué)研究。TLR4-/-是TLR4基因敲除小鼠其背景與C57BL/6小鼠(TLR4+/+)相同。研究表明，異基因骨髓移植后供者和受者來源的APC均可出現(xiàn)在受者的二級淋巴組織中，供者的T細胞受體(T cell receptor，TCR)可以識別受者APC(直接遞呈)或供者APC(間接遞呈)呈遞的異基因抗原。我們將實驗設(shè)計為TLR4+/+和TLR4-/-小鼠

6、分別做供者或受者與BALB/c小鼠之間相互進行骨髓移植，了解TLR4-/-與TLR4+/+的DC在參與直接遞呈和間接遞呈識別過程中，兩者相比受鼠發(fā)生GVHD的不同。通過觀察我們發(fā)現(xiàn)TLR4-/-小鼠無論作供鼠還是受鼠其移植后的嵌合體與TLR4+/+組相比發(fā)生GVHD程度均較輕、體重下降較慢、臨床GVHD評分較低、肝臟及小腸等器官、組織的受損程度較小，均預(yù)示TLR4-/-小鼠可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對特異性抗原的耐受，導(dǎo)致機體同種異體器官移植的

7、免疫耐受。此外我們還觀察到TLR4-/-小鼠做供鼠時移植后受鼠BALB/c發(fā)生GVHD時間(中位時間16.1天)較TLR4-/-小鼠做受鼠時其嵌合體發(fā)生典型GVHD(中位時間12.3天)的時間也要退后一些，解剖發(fā)現(xiàn)受鼠肝臟、小腸表面出血點程度更輕；我們認(rèn)為這可能是移植后受體淋巴組織中供體或受體來源的DC所占比例不同所造成的，當(dāng)TLR4-/-作為供鼠時，其提供的DC在移植后2周為嵌合小鼠淋巴組織中主要DC，因其遞呈異基因抗原使T細胞激活的

8、作用較弱，故誘導(dǎo)發(fā)生GVHD的程度要輕。
　　 本文在進一步的體內(nèi)外實驗中我們比較了TLR4-/-小鼠DC的抗原提呈能力、與同種異基因T細胞的混合淋巴細胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)、抑制T輔助細胞1型(T help cell type1，Th1)亞群的分化以及體外誘導(dǎo)同種抗原特異性T細胞低反應(yīng)性等來解釋其發(fā)生移植免疫耐受的免疫機制。近來的研究認(rèn)為在T細胞反應(yīng)的早期，當(dāng)童貞T細胞識別APCs

9、提呈的抗原時，APCs是否能夠表達足夠的CD86、CD80、CD40等共刺激分子決定了T細胞是否被完全活化，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，或是未被活化導(dǎo)致凋亡或無能。體外實驗我們發(fā)現(xiàn)TLR4-/-可以保護非成熟型DC不被外源性脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激所激活。我們的FACS數(shù)據(jù)表明，給予外源性LPS(1μg/ml)刺激24h，TLR4+/+小鼠Day-5-DC表達高水平CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ類分子，顯示

10、出成熟型DC的表型特征，白介素12(Interleukin12，IL-12)分泌水平明顯升高；而TLR4-/-小鼠Day-5-DC則維持在非成熟型狀態(tài)，DC的表型和IL-12分泌在LPS刺激前后幾乎無改變，對T細胞為低刺激活性。IL-12是由DC分泌的重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可以促進干擾素-γ(Interferongamma，IFN-γ)的分泌，引起CD4+T細胞增殖并向Th1細胞分化，IL-12的缺乏則T細胞增殖受抑。TLR4-/-小鼠在

11、LPS刺激后DC的非成熟狀態(tài)明顯抑制了其抗原提呈能力，減弱DC與同種異基因T細胞的混合淋巴細胞反應(yīng)，引起T細胞增殖的作用較弱，從而減輕GVHD的發(fā)生。在體內(nèi)實驗我們對骨髓移植后21天小鼠進行研究，供鼠是TLR4-/-組小鼠脾細胞來源的DC其表面共刺激分子CD80、CD86的表達與供鼠TLR4+/+組相比也明顯降低。TLR4基因的缺失可使DC維持非成熟型狀態(tài)，具備對T細胞的低刺激活性。一般認(rèn)為CD4+T細胞Th1亞群向Th2亞群漂移，可以

12、改變移植物局部的免疫反應(yīng)，抑制細胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。IL-2和IFN-γ是Th1亞群的特征細胞因子，而IL-10和IL-4是Th2亞群來源的細胞因子；IL-17為第三個T細胞亞群，在預(yù)防胞外病原體中扮演重要角色，其缺乏可導(dǎo)致炎癥的進展和嚴(yán)重的自身免疫疾病。
　　 本研究測定并分析了同種MLR反應(yīng)體外培養(yǎng)體系上清中Th1和Th2來源的細胞因子，發(fā)現(xiàn)TLR4-/-L小鼠來源非成熟型DC與新鮮分離BALB/c小鼠的CD4+T細胞作MLR

13、后，代表Th1亞群的細胞因子IFN-γ、IL-2水平明顯降低(p<0.01)，有意思的是代表Th2亞群的細胞因子IL-10和IL-4水平也表現(xiàn)為下降(p<0.05)。結(jié)果說明TLR4-/-小鼠DC可抑制Th1亞群的增生反應(yīng)，但并未誘導(dǎo)Th1亞群向Th2亞群偏移。此外TLR4+/+小鼠MLR上清中IL-17的水平與TLR4-/-組相比顯著升高，說明IL-17對GVHD的進展起促進作用。我們在MLR實驗中通過流式和羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞

14、胺酯(carbox fluorescenceindiacetate succinimidyl ester，CFSE)標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)TLR4-/-DC對異基因T細胞的活化作用減弱，與TLR4+/+組相比T細胞增殖明顯減少；本結(jié)果說明TLR4基因的缺失使DC在體外同種MLR反應(yīng)中能夠維持處于非成熟型狀態(tài)，不能充分活化T細胞，從而誘導(dǎo)T細胞對同種抗原的低反應(yīng)性。血清中Th1亞群分泌的細胞因子與嚴(yán)重的GVHD和死亡率相關(guān)。為了解小鼠移植后體內(nèi)來自

15、Th1亞群和Th2亞群細胞因子水平的變化；推測TLR4-/-DC在體內(nèi)對T細胞分化的影響；我們收集了移植后7天嵌合體小鼠的血清，供鼠為TLR4-/-的移植后受鼠血清中代表Th1亞群的IL-2水平明顯較低；而令人驚訝的是其血清中IFN-γ的水平正好相反，移植后第7天受鼠血清中IFN-γ水平與TLR4+/+小鼠組的比較明顯升高，考慮可能是除T細胞以外的其他細胞如自然殺傷細胞(Natural killercells，NKcells)、APC分

16、泌的較多量IFN-γ所至。這結(jié)果也與其他一些學(xué)者觀點符合：IFN-γ對GVHD起到保護作用，IFN-γ對活化T細胞起負(fù)調(diào)控作用，抑制細胞分化，促進細胞死亡，保護受體器官不受損壞。研究發(fā)現(xiàn)Th2相關(guān)的細胞因子可以下調(diào)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，拮抗Th1亞群的細胞因子效應(yīng)，從而減輕GVHD的發(fā)生。我們檢測發(fā)現(xiàn)代表Th2亞群的細胞因子IL-10水平在供鼠為TLR4-/-的嵌合小鼠血清中表現(xiàn)為明顯升高，提示可以抑制小鼠移植后GVHD的發(fā)生。此外移植后

17、第7天最大量成熟的DC遷移到淋巴組織，參與到遞呈抗原，活化T細胞的過程中，這一定程度解釋了實驗中發(fā)現(xiàn)移植后嵌合體小鼠血清中細胞因子檢測為何在第7天水平最高這一現(xiàn)象。影響GVHD的因素很多，在體內(nèi)這些因素相互關(guān)聯(lián)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)最終影響到GVHD的發(fā)生和嚴(yán)重程度，LPS/TLR4的信號傳導(dǎo)通路也是其中影響因素之一。我們從這個方面入手了解天然免疫分子TLR4在GvHD中所起的作用，最后得出結(jié)論TLR4基因在T細胞對APCs的刺激產(chǎn)生明顯的活化